野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范

1、DB福建省地方标准DB/×××2007野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范（报批稿）200×-××-××发布200×-××-××实施发布福建省质量技术监督局DB/×××2007前言本标准由福建省科技厅和福建省农业厅提出。本标准起草单位：福建省三明真菌研究所、福建农林大学菌物研究中心、福建省科技厅星火办。本标准主要起草人：黄年来、上官舟建、林汝楷、谢宝贵、林津添、张运茂、郭美英、朱坚、陈晓、吴小平、邓优锦、刘新锐。1DB/×

2、5;×2007野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范1范围本标准规定了野生食用菌菌种采集、采集前准备、标本采集与保存、菌种分离与鉴别等。本标准仅适用于野生食用菌,不适用于有毒真菌。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T12728-2006食用菌术语3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1食用菌ediblemushroom可食用的大型真菌，常包括食药

3、兼用和药用大型真菌，多数为担子菌，如双孢蘑菇、香菇、草菇、牛肝菌等，少数为子囊菌，如羊肚菌、块菌等。GB/T12728-2006，定义2.1.43.2药用菌medicinalmushroom有药用价值的高等(大型)真菌。GBT12728-2006，定义2.1.53.3木腐菌woodrottingmushroom自然生长在木本植物上可引起木材腐烂的大型真菌。人工栽培的食用菌多数是木腐菌，如香菇、金针菇等。GB/T12728-2006，定义2.3.103.4草腐菌strawrottingmushroom自然生长在草本植物残体上的大型真菌，如草菇、双孢蘑菇。GB/T12728-2006，定义2.3.

4、113.52土生菌geophilousmushroom自然生长在富含有机质的土壤中的各类大型真菌。如羊肚菌。GB/T12728-2006，定义2.3.143.6粪生菌coprophilousmushroom以腐熟动物粪便为营养源的腐生大型真菌。如粪污鬼伞。GB/T12728-2006，定义2.3.153.7菌根真菌mycorrhizalfungus能与植物根系发生互惠共生关系形成菌根的真菌。如松口蘑与赤松。由于真菌菌丝深入植物根部程度的不同又有外生菌根和内生菌根之分。GB/T12728-2006，定义2.3.193.8分离isolation从基物、子实体、菌丝培养物中取得纯菌种的过程。GB/T

5、12728-2006，定义2.4.343.9核糖体转录间隔区NuclearRibosomalDNAInternalTranscribedSpacers在真菌中，18S、5.8S、28S核糖体RNA的基因串联在一起，同时被转录，这三个基因之间被一段DNA序列隔开（ITS），18S和5.8S、5.8S和28S的基因之间的间隔区分别称为ITS1和ITS2，ITS序列具有较高的保守性，种内不同菌株之间的ITS序列同源性很高，但种间的差异较大，它可用于种的鉴别。4.采集4.1采集前的准备4.1.1工具采集前应备齐工具。采集工具包括小铲子或小锄子、锯子、高枝剪、柴刀、小篮子、采集袋、小瓶子、接种针、酒精灯

6、、试管培养基、小型烘干设备、照相机、闪光灯、三脚架、海拔表或卫星定位仪、铅笔、油膏笔、标本记录表、尺子、放大镜、当地交通图、指南针及其它需要物品等。4.1.2着装要求应穿长袖衣服、长筒裤，扎紧裤脚，以防止被杂草割伤或被蚊虫、蚂蟥等叮咬。4.1.3防护用品应带上草帽、雨伞、雨衣等遮阳防雨用具，以及防蚊虫叮咬的清凉油、风油精、蛇药、防中暑药和解渴充饥的开水和干粮等。4.1.4其它3应预先计划安排交通工具。应根据行动计划安排人员，并根据调查范围划分小组，原则上每个小组必须为2人以上。应制定联络方式。最好有适当的向导。4.2标本采集与记录4.2.1野生食用菌采摘用于菌种分离的材料主要是子实体，在采摘时

7、应尽可能保持子实体完整，包括菌环、菌柄基部、菌托等。4.2.2标本存放每一种标本应单独存放，防止互相干扰影响鉴定。应使用采集袋或样品盒等，以防止标本互相挤压。4.2.3拍照标本采集前应进行拍照。应拍摄子实体整体（包括菌环、菌柄基部、菌托等）、菌褶或菌管部分的照片，以及子实体周边的生态照片。4.2.4记录采集标本时应及时详细记录标本信息。记录标本信息用铅笔或油笔较好。标本记录表见附录A。5菌种分离5.1培养基分离菌种常用的培养基见附录B。5.2菌种分离方法根据采集菌株的营养类型和标本的完好程度决定是否分离菌种，所有木腐菌、草腐菌、粪生菌和部分土生菌应尽可能进行菌种分离，菌根真菌如红菇、乳菇、牛肝

8、菌等不用分离。常用的分离方法包括：a.组织分离法。以无菌操作方式，用接种针或刀片取子实体内部的一小块组织接入分离培养基中，在适宜的温度条件下培养以获得菌丝纯培养；b.耳木分离法。以无菌操作方式，用接种针或刀片取耳木内部的一小块组织接入分离培养基中，在适宜的温度条件下培养以获得菌丝纯培养；c.孢子弹射法。以无菌操作方式，在一支装有分离用培养基的试管内用接种针取一小块琼脂粘在试管壁上，再取一小片菌褶粘在试管壁上的琼脂块上，试管静置过夜，让菌褶上的担孢子弹射到分离用培养基上，在适宜的温度条件下培养以获得菌丝纯培养。6标本保存6.1标本在采集当天应在记录和分离菌种后及时烘干。6.2干标本带回单位后应及

9、时处理如分检、复烤、装标本瓶，并及时放入标本馆妥善保存。7菌种鉴别7.1形态鉴定对标本进行形态特征描述后，鉴定方法见附录C。47.2菌种鉴别7.2.1形态鉴别观察分离获得的野生菌种的菌落形态及菌丝的显微特征，与该种类的其它菌株进行比较，若相同，可判断所获得的菌种是正确的，不是杂菌。对于所采集到的野生菌目前还没有对照菌株，可进行出菇试验，若长出的子实体与野生子实体标本的形态特征相同，说明所获得的菌种是正确的，不是杂菌。若形态鉴别无法确认菌种或有疑义，应另作分子鉴别。7.2.2分子鉴别7.2.2.1DNA提取野生菌种在适合的液体培养基上培养，收集菌丝，提取总DNA。同时取其子实体标本，也提取总DN

10、A。7.2.2.2ITS-PCR野生菌种及其子实体的DNA分别进行ITS-PCR。PCR反应的组成及程序如下：PCR反应的组成：1l模板DNA(含30ngDNA)，2.5l10×buffer缓冲液，2ldNTP(each2.5mmol/L)，1lPrimerITS1(ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)(10mol/L),1lPrimerITS4(ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC)(10mol/L)，0.3lTaqDNAPolymerase(5U/ul),用ddH2O将总体积补至25l。ITS-PCR扩增反应程序：94预变性5min；94变性4

11、5s，55退火45s，72延伸1min,35个循环，72延伸10min。7.2.2.3ITS扩增产物的检测取ITS-PCR产物5l加上2l6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀,进行1.0%琼脂糖凝胶（含GoldviewTMDNA染料）电泳，160V恒压电泳1h，通过紫外凝胶成像系统观察并照像。7.2.2.4ITS片段的克隆与测序ITS-PCR产物与T-Vector连接后转化大肠杆菌，抗性菌落经过菌落PCR验证后，委托生物公司测序。7.2.2.5菌种鉴别采用DNAMAN软件比对野生菌种及其子实体的ITS序列，如果两条序列完全吻合，说明所获得的菌种是正确的，不是杂菌。如果同源性较低（低于98%），说明所分离的菌种与子实体标本不是同一种,可能是杂菌。5附录A（规范性附录）菌类野外采集记录表*采集号_标本采集份数_菌名产地生境针叶林阔叶林混交林灌丛草地草原阳坡阴坡河边路旁凹地中名：学名：经纬度：基物：地上腐木立木粪上朽叶海拔：米土质：红壤、沙壤、粘壤、沙地、采集时间：_年_月_日别名：习性形态特征备注采集人：鉴定人：*注：