第二章 DNA复制

1、DNA 复 制、损伤与修复n本章主要内容：本章主要内容： 复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程复制的过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复第一节第一节 DNA 复制复制复制复制(replication) 是指遗传物质的传代，是指遗传物质的传代，以母链以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA一、一、DNA的复制的复制DNA DNA 复复 制制 的的 基基 本本 特特 征征n半保留复制半保留复制: :AGGTACTGCCACTGGTC

2、CATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNAn子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度实验密度梯度实验: : 实验结果支持半保留复制的设想。实验结果支持半保留复制的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液

3、第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义: :遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制

4、接近终止点(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制33 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand) 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为前导链前导链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的能顺着解链方向连续延长，这股

5、不连续复制的链称为链称为后随链后随链(lagging strand) 。复制中的不连。复制中的不连续片段称为续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 前导链前导链连续复制而连续复制而后随链后随链不连续复制，就是复不连续复制，就是复制的制的半不连续性半不连续性。 n参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，简写为简写为 DNA-pol； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物

6、引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的酶和蛋白质因子。其他的酶和蛋白质因子。二、二、DNA复制的酶学复制的酶学一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应是复制的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi5 5-末端末端3 3-末端末端CGA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA链的方向是链的方向是5 5 3 3 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3

7、 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性2

8、0？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol In功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复

9、制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使

10、在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。n功能：功能： DNA-pol (250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。在真核生物在真核生物DNADNA链延长中起催化作用链延长中起催化作用，相当于原核生物的，相当于原核生物的DN

11、A-pol 参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512

12、.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对

13、规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。nDNA复制的保真性至少要

14、依赖复制的保真性至少要依赖 三种机制：三种机制：四、复制中的分子解链伴有四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC (dnaC)解解开开DNA双双链链

15、解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA (dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于氢键，使氢键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶。引物的酶。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

16、态并保护单链的完整。 108局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、超螺旋状态、理顺理顺DNA链链n复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反

17、应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：五、五、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的双链中的单链缺口单链缺口连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(D

18、NA ligase)作用方式：作用方式：POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用：连接酶的作用： DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不

19、连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。三、原核生物的三、原核生物的DNA生物合成生物合成E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCT

20、CTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

21、复制起始区域的复合结构称为引发体。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶（二）复制的延长过程：前导链连续复制，（二）复制的延长过程：前导链连续复制，后随链不连续复制后随链不连续复制复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-poln前导

22、链的合成：前导链的合成：前导链的子链沿着前导链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n后随链的合成后随链的合成n同一复制叉上前导链和后随链由相同的同一复制叉上前导链和后随链由相同的DNA-pol催化延长催化延长 阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空

23、缺、连接切口5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 随从链上不连续性片段的连接：随从链上不连续性片段的连接：（一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长： 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 n线性线性DNA复复制的末端制的末端 端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链D