目的基因的连接与转化ppt课件

1、目的基因的目的基因的衔接、转化衔接、转化分类及原理分类及原理分类：分类： 根据限制性内切酶酶切根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型，分为后产生的末端的类型，分为非互补突出末端的衔接、一非互补突出末端的衔接、一样粘性末端的衔接、平末端样粘性末端的衔接、平末端衔接衔接DNADNA衔接表示图衔接表示图载体自连及去磷酸化载体自连及去磷酸化常用碱性磷酸酶常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIAP(小牛肠)分子量 80,000温度 60 65最适PH8.0热稳定性好，100 暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量 100,000温度 37 最适PH10.0附近（高底物浓度）PH 8.0附近（低

2、底物浓度）6530分钟处理99的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理本实验衔接资料及衔接本实验衔接资料及衔接体系体系衔接表示图衔接表示图衔接体系衔接体系载体DNA 17 ng目的DNA 50 ng连接缓冲液（5） 1.2 ul用蒸馏水稀释至6ul附注：目的附注：目的DNA的总体积是的总体积是3ul，假设，假设不够总质量以总体积为准不够总质量以总体积为准1. 1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为为8 8：1 1到到1 1：1616，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是3 3：1 1到到

3、1 1：3 3。插入片段的长度。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的衔接效果。每一个衔接反响都需求和序列的变化会影响和同一载体的衔接效果。每一个衔接反响都需求作实验，来选择最正确的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反响作实验，来选择最正确的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反响体积中，通常一个衔接反响用体积中，通常一个衔接反响用10-50ng10-50ng的载体的载体DNADNA。2. 2. 进展衔接反响时的保温的时间和温度也需优化。普通而言，平末端衔进展衔接反响时的保温的时间和温度也需优化。普通而言，平末端衔接在接在2222保温保温4-164-16小时，粘性末端在小时，粘性末端在22

4、22保温保温3 3小时，或小时，或1616保温保温1616小时。大多数衔接反响用小时。大多数衔接反响用T4DNAT4DNA衔接酶，但大肠杆菌的衔接酶，但大肠杆菌的DNADNA衔接酶可用衔接酶可用于粘性末端的衔接，平末端衔接时用此酶，活力较低。于粘性末端的衔接，平末端衔接时用此酶，活力较低。 3. 3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好运用灭菌的双蒸水而载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好运用灭菌的双蒸水而不是不是TETE，毕竟，毕竟TETE中含有离子，能够影响衔接反响。中含有离子，能够影响衔接反响。感受态细胞的制备感受态细胞的制备HanahanHanahan法是制备高效感受态细

5、菌的规范方法。法是制备高效感受态细菌的规范方法。这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可到达这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可到达109 cfu/g DNA109 cfu/g DNA。注：注：1.1.低温培育，低温培育，1818培育至培育至OD600OD600约为约为0.50.5； 2. 2.超净台无菌操作，低温操作；超净台无菌操作，低温操作； 3. 3.规范质粒的种类不同同种感受态的转化率不规范质粒的种类不同同种感受态的转化率不同，不同质粒形状转化率也不一样。同，不同质粒形状转化率也不一样。转化原理转化原理1. 0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层构成液晶构造，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶分开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2. 参与DNA，Ca2+又与DNA结合构成抗脱氧核糖核酸酶DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外外表上；3. 经短暂的42热脉冲处置后，细菌细胞膜的液晶构造发生猛烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性添加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜DMSO和二巯基苏糖醇DTT进一步诱导细胞产生高频感受态的程