Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子诱导出的iPS细胞可分化成神经细胞

1、诱导产生多能性干细胞的研究里程碑式的科学突破细胞重编程的研究概况核移植n核移植试验最初是在两栖动物中实现的，通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中。迄今，人们已经获得了多种核移植动物，也建立了来源于核移植胚胎的胚胎干细胞系。体细胞核移植试验也具有很大的局限性n克隆的效率极低n产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常n由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑n这些不足，都制约了核移植技术的进一步发展和应用。 将成熟的体细胞与多潜能的细胞（ES细胞、胚胎癌细胞等）融合，或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞，也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。n利用这两种方法，可以实现某些多

2、功能性标志分子的重新表达和多种分化潜能的获得。n但是，体细胞与多能性细胞的融合率较低，融合之后的细胞具有两套染色体，并且在移植后会发生排斥现象，这就制约了细胞融合的临床应用。有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？里程碑式的科学突破n2006年11月20日，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka)和美国威斯康星大学的詹姆斯汤姆森（James Thomson）分别在细胞和科学杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。詹姆斯汤姆森小组的论文发表在11月20日

3、的科学杂志上俞君英是11月20日科学杂志论文的第一作者2006年8月，日本科学家山中伸弥小组首先在小鼠身上取得成功诱导产生的多功能性干细胞n2006年，Takahashi 和 Yamnaka 将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导产生的多功能性干细胞”（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态，因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。在研究诱导多功能性干细胞产生的原理机制之前，先了解一下体细胞重编程逆转为干细胞的

4、研究进展n体细胞重编程的过程n体细胞重编程的原理n体细胞不经过胚胎逆转为多能干细胞的方法成体细胞核的重编程n1.核重编程：核移植后供体核停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态。此过程包括：染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X染色体失活等。n 1.1.DNA甲基化n 1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-4n2.重塑核结构n 主要有包括核纤层A、B、C三种核纤层蛋白的重塑3.细胞质重编程miRNAnmiRNA是决定细胞分化方向的因子。n 细胞中miRNA成分的改变能提高细胞对调节基因表达重编程。n接下来，介绍一下体细胞重编程

5、不经过胚胎逆转为多能干细胞的方法之一：通过特定基因的表达将体细胞重编程过程逆转为干细胞。“基因重新编排技术”，借助“逆转录酶病毒”为载体,即向皮肤细胞中植入一组4个基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通过基因重新编排，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。这种被改造过的细胞称作“iPS细胞”。n下面简单介绍一下这些研究中所用到的多能性相关因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性调控中的作用。1.Oct3/4nOct-4（也称Oct-3）属于POU转录因子家族的一员13 。n是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志，它能够促使ICM形成、维持胚胎干细胞未分化

6、前状态并促进其增殖。2.SOX2基因 nSOX2基因是编码转录因子的主控基因（master genes）家族的一个成员。转录因子是些与DNA结合并调节其他基因表达的蛋白质3.癌症基因c-MYC n癌症基因c-MYC，是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因，它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES细胞的分化。4.Klf4nKrueppel-like factor 4，KLF4上皮锌指转录因子Klf4 (旧称GKLF)调节体外细胞的增生与分化 iPS细胞诱导机制已分化的细胞导入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆转录胚胎干细胞培养条件和筛选Ips细胞诱导多功能细

7、胞n我们已经了解了体细胞重编程的原理和诱导多功能干细胞的产生机制，下面让我们再深入了解一下Ips细胞的研究概况和Ips细胞系建立的一些重要环节。Ips细胞的研究概况（研究方法）这是一种具有很强创新性的研究方法：通过外源导入与多功能相关并且能使重组细胞恢复全能性的转录基因来诱导体细胞核发生重新编程，从而使体细胞转变成多能性干细胞。n这种方法所受的启示来源于“ ES细胞-体细胞融合实验”。细胞的多能性收到许多因子精密而又复杂的调控。ES细胞和体细胞融合后能诱导体细胞核的重新编程，ES细胞中存在着一些因子，这些因子对于多能性的建立可能至关重要。Ips细胞的研究概况（两个相关实验）nIps细胞首先由科

8、学家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。实验原理如下：利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多功能性有关的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终的到了ips细胞，这种细胞的功能和性能几乎和胚胎干细胞一样。n另一个实验的对象是人类皮肤成纤维细胞的重编程，而实验的过程和上一个实验基本相同；。只是对所筛选的转录基因做了一下修饰：去掉了肿瘤相关因子c-Myc，使ips细胞的生产更加安全Ips细胞系建立的一些重要环节（几种因子的发现过程）n日本科学家发现ES细胞中那个存在着一些因子，这些因子对于多能性

9、的建立可能至关重要。科学家对24个与多能性维持相关的候选基因导入小鼠成纤维细胞中，依次去掉其中一个基因，最后在得到的10个基因中发现了4个至关重要的基因，其中任何一个缺失都将导致实验的失败，这4个基因中的任意2个或3个组合都无法形成具有ES细胞特性的ips细胞。从而确定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4这4种基因n人类ES细胞能够通过细胞融合实验室体细胞发生重编程。美国科学家比较了人类ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞中相对高表达的基因。再根据这些基因在多能性调控中的已知功能对其进行了排序，从中选出14个候选基因。将这

10、些基因以不同的组合方式导入一种由人类ES细胞分化得到的间充质样细胞后，检验了不同基因的导入对这种细胞重编程的作用。最后锁定了4种因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.Ips细胞系建立的一些重要环节（Ips细胞的筛选） Ips细胞的筛选：主要有三种方法：形态学筛选、药物筛选和选用对多能性更为关键的基因作为报告基因。其中利用Fbx15对ips细胞进行筛选，原理是Fbx25对于多能性的维持和胚胎的发育来说是不可缺少的基因，所以Fbx25作为筛选ips细胞的报告基因。 仅利用形态学的标准来代替报告基因的筛选。Maherali等人发现，仅仅依靠形态学筛选可能就足以建立ips细胞系。后来的研究

11、证实了在不对供体细胞做任何额外遗传修饰的情况下，仅依靠形态学筛选的标准对细胞进行筛选也能够分离出小鼠的ips细胞。利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的体细胞，这些细胞的抗性受内源性Nanog或Oct4表达的调控。这两个基因的作用是维持细胞多能性，从而利用这种筛选的方法建立了稳定的ips细胞系，这些细胞系在各个方面都表现出了极为相似的特性。1、利用、利用iPS细胞作为实验模型，只操细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。调控机理的深入研究。2、获得的方法相对简单稳定，不涉、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。

12、及胚胎的破坏，无伦理道德限制。3、对于疾病机理研究和新药开发等、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。方面将有很大贡献。4、可望制造特定病人来源的、可望制造特定病人来源的iPS细胞，细胞，用用“个性化个性化”移植来治疗诸多疾病。移植来治疗诸多疾病。诱导性多能干细胞诱导性多能干细胞用于治疗小鼠帕金用于治疗小鼠帕金森病森病 美国麻省美国麻省Whitehead生物医学研究的生物医学研究的Wernig等近等近日报告日报告,通过通过Oct4、Sox2、Klf4和和c-Myc四种转录四种转录因子诱导出的因子诱导出的iPS细胞可分化成神经细胞细胞可分化成神经细胞,可改善帕可改善帕金森病小鼠的运动功能

13、。金森病小鼠的运动功能。 研究者首先检验了研究者首先检验了iPS细胞在体外的分化细胞在体外的分化能力能力,发现发现iPS细胞可以分化成神经元细胞细胞可以分化成神经元细胞和神经胶质细胞和神经胶质细胞,并且能够进一步生成神经并且能够进一步生成神经元亚型细胞元亚型细胞 未分化的未分化的iPS细胞细胞 iPS细胞在体外分化成神经细胞细胞在体外分化成神经细胞n随后随后,研究者用荧光物质标记研究者用荧光物质标记iPS细胞细胞,将其入注射入胚胎小鼠的脑室内。将其入注射入胚胎小鼠的脑室内。9周后周后(小鼠出生后小鼠出生后),研究者发现研究者发现,iPS细胞可迁移到小鼠脑的各个区域。细胞可迁移到小鼠脑的各个区域

14、。,包括包括脑膜、纹状体、下丘脑、中脑等部分脑膜、纹状体、下丘脑、中脑等部分,并且可分化成神经胶质细胞和神经并且可分化成神经胶质细胞和神经元元,包括谷氨酸性突触、包括谷氨酸性突触、氨基丁酸能神经元和儿茶氨酚能神经元等亚型氨基丁酸能神经元和儿茶氨酚能神经元等亚型,因因为这些分化出的细胞具有神经细胞的形态为这些分化出的细胞具有神经细胞的形态,并且表达其特异的标志物并且表达其特异的标志物 iPS细胞植入小鼠大脑后的分布情况细胞植入小鼠大脑后的分布情况iPS细胞分化的细胞具有神经细胞形态细胞分化的细胞具有神经细胞形态iPS细胞分化的细胞表达神经细胞特异标志物细胞分化的细胞表达神经细胞特异标志物n电生理

15、记录和形态学分析表明电生理记录和形态学分析表明,iPS细胞分化细胞分化出的神经元细胞植入小鼠体内后出的神经元细胞植入小鼠体内后,具有神经元具有神经元和突触的形态和突触的形态,参与小鼠的电生理活动，因而参与小鼠的电生理活动，因而可增强受植小鼠大脑的神经元活性并参与脑可增强受植小鼠大脑的神经元活性并参与脑功能。功能。iPS细胞分化出的神经元细胞可发生膜电位改变细胞分化出的神经元细胞可发生膜电位改变 n研究者对小鼠大脑一侧注射神经毒性物研究者对小鼠大脑一侧注射神经毒性物质质6-羟基多巴胺羟基多巴胺,使该侧内产生神经递质使该侧内产生神经递质多巴胺的神经元死亡。这可破坏该侧大多巴胺的神经元死亡。这可破坏

16、该侧大脑纹状体脑纹状体,即大脑中负责运动控制的区域即大脑中负责运动控制的区域,模拟了帕金森病发生时的情况。经过这模拟了帕金森病发生时的情况。经过这样处理的小鼠运动控制功能受损样处理的小鼠运动控制功能受损,因此无因此无法保持平衡而法保持平衡而持续旋转持续旋转。n接着，研究者对接着，研究者对iPS细胞进行特殊处理细胞进行特殊处理,确保这些确保这些iPS分化成为多巴胺能神经元分化成为多巴胺能神经元,将其植入小鼠大脑运动功将其植入小鼠大脑运动功能受损的一侧能受损的一侧(接受接受6-羟基多巴胺注射的一侧羟基多巴胺注射的一侧)。几。几周后研究者发现周后研究者发现,10只受移植的小鼠中有只受移植的小鼠中有9只的运动只的运动功能得到显著改善，其中甚至有功能得到显著改善