人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

1、    人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆 及其真核表达的研究        【摘要】目的克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白(MCP)的cDNA，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法应用RT-PCR方法,从U937细胞总RNA中扩增编码人MCP分子的cDNA片段,快速克隆于pGEM-T Easy载体，测定其序列。将该片段重组于pLXSN载体，电穿孔转染NIH3T3细胞，经FACS检测筛选表达MCP的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果R

2、T-PCR扩增得到1144bp的编码人MCP分子的cDNA片段，序列分析表明该cDNA编码的蛋白为STC+CYT2亚型。细胞转染筛选获得多个表达MCP的NIH3T3阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论本研究为进一步探讨不同亚型结构的MCP分子与功能的关系及其应用奠定了基础。【主题词】补体膜辅助调节蛋白补体调节蛋白基因克隆基因表达 Molecular cloning and expression of human complement membrane cofactor proteinBAI Yun*, JIAN Man, WANG Gengyin，e

3、t al.*Department of Immunology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038【Abstract】ObjectiveHuman membrane cofactor protein (MCP,CD46) is a cell surface glycoprotein acting as a cofactor for the factor I-mediated inactivation of C3b and C4b, which is also a receptor for measles virus (

4、MV). MCP exists in several isoforms which are variably expressed in different human tissues. These isoforms differ in their cytoplasmic and transmembrane regions and in a portion of their proximal extracytoplasmic region. The purpose of this study is to obtaine the cDNA sequence encoding human MCP,

5、and express it on xenotypic cells for further studying. MethodscDNA fragment was amplified with RT-PCR method. The fragment was cloned into pGEM-T Easy plasmid, and further sequenced using Dye Terminator Cycle Sequencing Kit with AmpliTaq DNA Polymerase by ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer. Furthermore,

6、 the cDNA of MCP was transfected into NIH3T3 cells using the pLXSN retroviral vector. ResultsThe cDNA fragment we have cloned from U937 cells including 1144bp open reading region ,which encoded the signal peptide, four extracellular short consensus repeat domains (SCRs), a Ser/Thr (STC)-rich region,

7、 a transmembrane region and a cytoplasmic tail(CYT2).Its sequence was identical to the published sequence encoding STC/CYT2 isoform of human MCP. When it expressed on the mouse NIH3T3 cells surface stably, the transfected cells were resistant to human complement-mediated cell killing. ConclusionThe

8、results suggest that the gene for MCP can be expressed in xenotypic cells to confer protection against human serum complement.【Subject words】Membrane cofactor proteinComplement regulatory proteinsMolecular cloningGene expression补体膜辅助调节蛋白（membrane cofactor protein，MCP，CD46）是跨膜型细胞表面糖蛋白，具有广泛的细胞及组织分布，属于

9、补体活化调节因子基因簇（regulator of complement activation gene cluster，RCA）的成员。其蛋白分子含有4个SCRs结构，有多种变异型，不同变异型的组织细胞分布及功能有所差异1，2。MCP的主要功能是辅助I因子降解C3b 和C4b，它与CR1、CD55和CD59一起有效地控制补体的活化，保护宿主细胞免受补体介导的杀伤3。近年的研究还揭示了MCP是麻疹病毒（measles virus，MV）的受体，与MV感染及感染后引起的免疫抑制密切相关4，5。此外，MCP分子在生殖免疫6、微生物及肿瘤的免疫逃避、异种器官移植超急排斥反应、自身免疫性疾病等方面都具有

10、重要的意义7；并且在MV感染的治疗、超急排斥反应的控制及多种免疫性疾病的治疗方面显示了良好的应用前景8。本研究应用RT-PCR方法,从U937细胞总RNA中扩增得到编码人STC+CYT2亚型MCP分子的cDNA序列，经基因转染获得表达MCP的小鼠NIH3T3细胞克隆,并初步探讨了其对人补体溶破的抑制功能。为进一步研究不同变异型MCP分子的结构与功能的关系、探讨其病理生理意义奠定了基础。材料与方法主要试剂：质粒载体pGEM-T Easy购自Promega公司；逆转录病毒载体pLXSN为本室保存；TitanTM One Tube RT-PCR试剂盒购自Boehringer Mannheim公司；限

11、制性内切酶、T4连接酶购自华美公司；anti-MCP单抗购自Serotec公司。引物设计和合成：设计合成了一对分别位于编码MCP分子cDNA序列的上下两侧引物，中间包含了包括34aa信号肽在内的完整的MCP编码序列。PCR引物由上海细胞研究所合成。Primer1:5-GCGGAGAAATAACAGCGTCTTCCG-3；Primer2:5-CGCTATTCAGCCTCTCTGCTCTGC-3。细胞总RNA的提取：采用MCP高表达的U937细胞系，参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA，提取物于1.5%的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。RT-PCR扩增：参照TitanTM One Tube RT-PCR

12、System说明书并加以改进，以反义引物进行RT-PCR扩增。取8l PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。扩增片段以Stu、BamH酶切鉴定。扩增片段的基因克隆和序列分析：将PCR产物纯化回收后，与pGEM-T载体连接，转化入E.coli JM109后经氨苄青霉素及-互补筛选，用EcoR酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列分析由上海公司进行自动测序操作。重组表达质粒pL-MCP的构建：按2的方案进行，DNA重组技术如DNA片段的回收、酶切、连接、转化等均参照文献方法。基因转染：按文献的方法，用电穿孔法将pL-MCP质粒导入NIH3T3细胞，同时导入pLXSN空载体对照；G

13、418加压筛选重组细胞克隆。FACS检测重组细胞MCP的表达：随机挑选pL-MCP转染的NIH3T3细胞5株，调整为105/ml，用anti-MCP McAb进行免疫荧光染色。补体杀伤实验：转染pL-MCP的阳性NIH3T3细胞及pLXSN空载体转染对照细胞用PBS调整为105/ml，每孔加100l。新鲜正常人血清（NHS）用PBS进行倍比稀释，每孔100l，37作用60分钟。加入MTT（5mg/ml）20l/孔，37作用4小时，离心弃上清，每孔加入DMSO 150l，室温5分钟后测定其A570值。每个样品均做3个复孔。结果1.U937细胞总RNA的提取：MCP广泛分布于人体各组织细胞表面，但

14、在不同的组织细胞的表达有所差异。我们选择高表达的U937细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA 28S、18S、5S三带明显，且28S>18S。紫外测定表明A260/A280>1.8，说明抽提的总RNA完整，且纯度符合反转录要求。2.RT-PCR扩增：获得1144bp的单一片段。用Stu酶切PCR扩增片段后得到258bp和886bp片段，BamH酶切后得到519bp，345bp和280bp三个片段，符合已知的MCP cDNA片段的限制性酶切谱，初步证明扩增得到的1144bp片段是MCP的cDNA(1)。1PCR产物及其酶切鉴定谱Fig 1. Digestion

15、map of PCR productsLane 1：DNA/EcoR+Hind,Lane 2： PCR product digested with BamH, Lane 3： PCR products digested with Stu，Lane 4：PCR products 3.扩增产物的克隆：扩增的MCP cDNA与质粒pGEM-T Easy连接，经氨苄青霉素抗性及-互补筛选后，用EcoR酶切鉴定，阳性重组子可切出1144bp的片段，说明cDNA已克隆于载体中，命名为pGEM-MCP。4.克隆片段的DNA序列分析：pGEM-T Easy是可以直接测序的载体，因此我们以重组质粒为模板进行测序

16、，得到了克隆片段的DNA序列，经计算机分析，与已知的包括34aa信号肽序列的STC+CYT2型MCP cDNA序列一致，表明我们已经克隆了人MCP cDNA的全部编码序列。5.重组逆转录病毒载体pL-MCP的构建：重组质粒构建示意如2，用EcoR从pGEM-MCP质粒上切下1144bp的MCP cDNA片段，克隆进入逆转录病毒载体pLXSN之中，以小量快速抽提质粒法选取重组质粒。为了确定插入片段的方向，用Stu酶切鉴定，如3所示。选择出正向连接的重组克隆，命名为pL-MCP。2重组质粒pL-MCP的构建Fig 2. Construction of recombinant pL-MCP3重组质粒

17、pL-MCP的酶切谱Fig 3.Digestion map of pL-MCPLane 1： DNA/EcoR+Hind，Lane 2： pL-MCP digested with EcoR，Lane 3： pL-MCP digested with Stu，Lane 4： pL-MCP digested with Stu6.pL-MCP转染细胞及MCP表达鉴定：将pLXSN和pL-MCP转染的NIH3T3细胞随机挑选G418抗性克隆数个，用anti-MCP单抗染色后，FACS检测其MCP的表达情况，结果显示多株克隆均有不同程度的表达，表达率为43%62%。选取高表达克隆扩增传代，命名为3T3/M

18、CP（4）。4FACS测定重组3T3细胞MCP的表达Fig 4. Expression of MCP on NIH3T3 cells7. 3T3/MCP对人补体的抑制作用：小鼠NIH3T3细胞能够激活人补体旁路途径，如5所示，表达MCP的阳性细胞比对照细胞对补体溶破的抑制作用明显。53T3/MCP对人补体的抑制作用Fig 5. Inhibition of human complement lysis on 3T3/MCP cells讨论MCP的组织分布广泛，表达于除红细胞之外的所有造血干细胞、纤维母细胞、表皮和内皮细胞系及神经系统的星状胶质细胞9，但在不同类型的细胞表达量有所不同。在细胞系中，

19、MCP高表达于U937、K562和HSB2细胞；而在Molt-4、Daudi、和Raji细胞表达较低，因此，我们选择U937为原材料进行RT-PCR扩增，以获得MCP的cDNA。MCP为跨膜型细胞膜表面糖蛋白，在SDS-PAGE上表现为非均一的特殊的宽双带，具有8种不同的变异型。其编码基因与其它RCA家族成员一起连锁定位于第1号染色体，长度至少43kb，含14个外显子和13个内含子。第1个外显子编码5非翻译区和信号肽，第26个外显子编码4个SCRs，其中SCR-1、-3、-4由单一外显子编码，SCR-2由2个外显子编码。第79外显子编码富含丝氨酸/苏氨酸O-糖基化区域（S/T区），第10外显子

20、编码功能不明区，第11、12外显子编码跨膜区和部分胞浆区。第13和14外显子可有不同的剪接，第13外显子存在时，它编码长16aa的胞浆尾（称为CYT1），第14外显子编码3非翻译区；如第13外显子存在时，第14外显子编码长23aa的胞浆尾（称为CYT2）和3非翻译区。现已证明，MCP蛋白的变异型是由于在转录过程中，CYT段和S/T区的不同剪接所造成。在S/T区含有7、8、9三个大小相同的外显子，分别称为STA、STB和STC，能产生4种变异型：STABC、STBC、STB和STC。蛋白电泳中STABC变异型者相对分子质量为6700075000；STBC为6200067000；STC为54000

21、56000，这种宽范围的变化可能与翻译后的修饰有关10。本实验所克隆得到的MCP cDNA长1144bp，含32bp的5非翻译区和一个编码369aa的开放阅读框架。其中前102bp编码34aa的信号肽，后1005bp包括4个SCR区、STC区、跨膜区和由CYT2编码的胞浆尾，共335aa。其变异型为STC+CYT2。MCP作为一种补体调节蛋白具有非常重要的功能，它可与C3b或C4b结合，促进I因子对其进行裂解。MCP的这种辅助因子活性比H因子高50倍，能够有效地控制补体的活化，保护宿主细胞免受补体介导的细胞杀伤，因此在移植免疫、肿瘤免疫、生殖免疫等方面受到人们的重视。本研究建立了表达MCP的小

22、鼠NIH3T3细胞系，并证明其具有抑制补体经典途径和旁路途径的活化作用，这不仅对深入探讨不同变异型结构的MCP分子与补体抑制功能的关系有一定的意义，而且为进一步研究MCP分子的其它功能及应用奠定了基础。作者单位：400038 重庆，第三军医大学基础部免疫教研室(白云，姜曼，朱锡华)；河北省石家庄市白求恩国际和平医院检验科(王更银)参考文献1Seya T,Turner J,Atkinson JP. Purification and characterization of membrane cofactor protein (gp 45-70) which is a cofactor of C3b

23、 and C4b. J Exp Med， 1986，163?837-855.2Lublin DM，Liszewski MK, Post TW, et al. Molecular cloning and chromosomal location of human membrane cofactor protein(MCP): evidence for inclusion in the multi-gene family of complement regulatory proteins. J Exp Med，1988，168?94-99.3Ballard LL, Bora NS, Yu GH,e

24、t al. Biochemical characterization of membrane cofactor protein of the complement system. J Immunol，1988，141?3923-3929.4Dorig RE, Marcill A, Chopra A, et al. The human CD46 molecule is a receptor for measles virus.Cell，1993，75?295-305.5Naniche D, Lublim DM, Holers VM, et al. Human membrane cofactor protein (MCP) acts as a cellular receptor for measles virus. J Virol，1993，67?6025-6032.6Anderson DJ, Michaelson JS, Johnaon PM, et al. Trophoblast leucocyte-common antigen is expressed by human testicular germ cells and appears on the surface of acrosome-reacted sperm. Biol Peprod， 1988，41?285-29