体外循环前后不同组织细胞因子的差异表达

1、体外循环前后不同组织细胞因子的差异表达         10-01-29 11:01:00     编辑：studa20                作者：齐弘炜，吴明营，韩欣刚，陈楠，张吉涛，赵凤华，孙婷婷，朱朗标 【摘要】  目的 应用基因芯片技术探讨外周血单个核细胞(PBMC)及心房组织细胞

2、因子的差异表达基因，探讨不同组织对体外循环(CPB)的反应。方法 CPB开始、CPB结束即刻抽取患者动脉血，密度梯度离心法分离PBMC;取CPB开始及CPB结束即刻的右房组织。用BD AtlasTM cDNA Expression Arrays表达谱基因芯片对比CPB前及CPB后二者间细胞因子的差异表达。结果 CPB前PBMC及心房间细胞因子基因表达差异明显者有IL-6、IL-13、Wnt5a、促肾上腺皮质激素释放激素型受体、卵泡刺激素受体和盘状结构域受体2。CPB后二者的基因表达谱均发生变化，差异明显者变为IL-6、IL-13、-干扰素诱导蛋白(IFI616)、钙结合蛋白S100A9(钙颗粒

3、素B)、胎盘生长因子和Wnt5a。结论 CPB前PBMC与心房组织的细胞因子基因表达谱不同，CPB刺激后基因表达谱发生变化，但变化不一致，使差异表达基因发生变化。 【关键词】  细胞因子;基因表达;基因芯片;外周血单个核细胞;心肌;体外循环Abstract: OBJECTIVE To determine the differentially expressed genes of cytokines between peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and right atrium using gene chip technique. T

4、o explore the reactions to cardiopulmonary bypass(CPB) in the different tissues.METHODS The patients' oxygenated bloods were drawn immediately before onset and termination of CPB. PBMC were obtained from heparinised blood by Ficoll gradient centrifugation. Right atrium were collected just before

5、 onset and termination of CPB. The differential expression between PBMC and atrium was compared using BD AtlasTM cDNA Expression Arrays. RESULTS Between PBMC and right atrium before CPB, the differentially expressed genes were interleukin 6, interleukin 13, Wnt5a, corticotropin releasing hormone rec

6、eptor 1 (CRH1R), follicle stimulating hormone receptor (FSH-R) and discoidin domain receptor family, member 2 (discoidin domain receptor, DDR2). Both of the gene expression profiles changed after CPB. The differentially expressed genes between PBMC and right atrium were interleukin 6, interleukin 13

7、, interferon alpha-inducible protein (clone IFI-6-16), S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B), placental growth factor and Wnt5a. CONCLUSION The gene expression profiles in cytokines of PBMC and right atrium were different before CPB. The gene expression profiles changed in different manner

8、s after CPB. So, the differentially expressed genes changed.Key words： Cytokine; Gene expression; Gene chip; Peripheral blood mononuclear cell; Myocardium; Cardiopulmonary bypass体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)手术中的创伤、低温、缺血-再灌注及血液与异物的接触触发了全身系统性炎症反应，其中细胞因子起传递介质的作用。生理状况下，同一种基因在不同的组织中表达量不同，对CPB反应也不相同1-2

9、;病理状态下，CPB后基因表达谱也不相同3。即使同一种细胞，来自于同一个体不同的生活环境，其基因表达也不同4。外周血单个核细胞(PBMC)是主要的细胞性炎性反应成分，也是体液性炎性因子的来源之一，但不是主要来源5。CPB中基因芯片技术的方法应用较少，PBMC与心肌组织基因表达谱的差异尚未见报道，对CPB反应的差异也未见文献报道，对其研究可能有助于详细阐述CPB对细胞因子产生的影响。1 资料与方法1.1 一般资料 选择1例心脏瓣膜置换的女性患者作为基因芯片标本来源：30岁，49 kg，心功能级(NYHA)，左心室射血分数(LVEF)55%，CPB时间68 min，主动脉阻断时间(ACC)26 m

10、in，最低鼻咽温/肛温27/30.4，心肌保护采用41含血心脏停搏液。试验符合医学伦理学准则并得到医院批准，得到患者的知情同意。1.2 方法 CPB开始前及CPB结束即刻抽取10 ml氧合动脉血，沿管壁缓慢加于淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)之上，使界面保持清楚。4、500×g离心20 min。小心吸取上层血浆和中间分离液层之间的白色云雾层得到PBMC，分别加入2个Eppendorf管中，4，400×g离心10 min。丢弃上清液，留取细胞。在每管中各加入0.5 ml TRIzol Reagent(Molecular Research Center, Inc,

11、USA)，吹打使细胞团完全溶解，吸至同一管内，-70-80低温冰箱保存备用。升主动脉插管、上下腔静脉插管后，CPB开始前及CPB结束即刻取右房组织，约半粒黄豆大小，迅速放入冻存管内，液氮冻存备用。1.3 芯片杂交方法及结果分析 将冻存的PBMC和TRIzol Reagent混合物取出，室温融化。取冻存的心房组织约100 mg研碎，加入1 ml TRIzol Reagent，吸入1.5 ml的Eppendorf管室温放置5min。用TRIzol Reagent一步法提取标本总RNA，RNA纯度大于1.8，RNA电泳，紫外灯下清晰可见18 s、28 s RNA带。上述RNA产物分别按BD Atla

12、sTM cDNA Expression Arrays(7744-1，BD Biosciences Clontech,USA)说明书进行以下实验操作：用MMLV逆转录酶合成cDNA探针，柱层析法分离cDNA探针(14 000 rpm离心)。将cDNA芯片放进自封袋，然后放入杂交瓶，68下持续转动预杂交30 min，加入含有32P的cDNA探针，使两种溶液混匀，排气后封口。cDNA探针与BD AtlasTM Array于68下持续转动杂交24 h。68下冲洗液充分漂洗cDNA探针芯片。用镊子夹取芯片，甩去多余的冲洗液，快速将芯片放入保鲜膜中，将保鲜膜包装的芯片于磷屏显像系统显像过夜。应用Molec

13、ular Dynamics系统(STORM 820, USA)扫描磷屏，应用AtlasImage 1.01a软件对扫描结果进行分析处理，对照BD AtlasTM Gene Lists Version 5.0总结分析。芯片结果比值在2倍以上或Undefined、且差值大于20者为表达有差异。2 结 果CPB前PBMC及右房组织细胞因子基因表达谱不同，差异明显者有IL-6、IL-13、Wnt5a、促肾上腺皮质激素释放激素型受体(CRH1R)、卵泡刺激素受体(FSH-R)和盘状结构域受体2(DDR2)，见表1和图1(见封三)。CPB后二者表达谱均发生变化，差异明显者变为IL-6、IL-13、-干扰素

14、诱导蛋白(IFI616)、钙结合蛋白S100A9(钙颗粒素B)、胎盘生长因子(PlGF)和Wnt5a，见表2和图2(见封三)。表1 CPB前PBMC与心房组织细胞因子差异表达基因表2 CPB后PBMC与心房组织细胞因子差异表达基因3 讨 论生物学已经进入了基因组时代，随着人类基因组测序工作的完成，不少科学家认为基因组研究应进入一个内涵更丰富、更深刻的阶段，获得基因的功能表达谱是这一阶段的核心，从物理学的角度讲，是将人类基因组上的静的基因图谱向时、空展开。确定生物体不同生命过程中基因的表达谱对阐明基因的作用有重要意义。基因芯片技术作为一种平行、大通量、同时检测生理或病理情况下基因表达的工具，在基

15、础医学及临床应用基础研究中应用广泛，但在CPB病理生理相关研究中尚不多见1，3，5-6。此实验设计应用细胞因子表达谱基因芯片筛选CPB手术前后的不同组织差异表达基因，观察其对CPB的反应，以更全面地了解CPB对机体的影响，为将来可能的干预提供理论依据并指明方向。CPB引起的全身性炎症反应过程伴随着细胞因子的变化，严重者导致全身炎症反应综合征，影响术后转归。以往，一般认为释放细胞因子是单核细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞等对补体激活和缺血-再灌注损伤的一种反应。而Tomic等5应用基因芯片和多蛋白分析研究了体外循环冠状动脉旁路移植术和非体外循环冠状动脉旁路移植术患者的炎性反应、白细胞转录谱发现，4868条基因中有45条在CPB开始后发生明显变化，血浆蛋白质表达谱也发生变化，但循环中的白细胞不是造成蛋白质表达谱变化的主要原因。CPB后循环中的白细胞对黏附因子和信号因子的表达增强，可能