利用光学多通道分析仪与分光光度计测定叶绿素的紫外_可见光区吸

1、物理实验第25卷第12期PHYSICSEXPERIMENTATION2005年12月Vol.25No.12Dec.,2005利用光学多通道分析仪与分光光度计测定叶绿素的紫外2可见光区吸收光谱刘畅,王世才,卢东昱(中山大学物理学系,广东广州510275)摘要:应用分析化学中常用的吸光光度法,通过光学多通道分析仪和紫外2可见分光光度计对叶绿素提取液和叶绿素晶体分别进行了紫外2可见光区吸收光谱的探测,并对其吸收曲线进行了分析和研究.根据实验结果对文献中的一些数据进行了讨论.关键词:吸光光度法;叶绿素;紫外2可见吸收光谱中图分类号:O433.51文献标识码:A文章编号:100524642(2005)1

2、2200382041引言.实验时,测,以波长为横坐标,吸光度为纵坐标作图,得到该物质的光吸收曲线.实验证明,溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关.Lambert和Beer分别于1760年和1852年研究了光的吸收与液层厚度及溶液浓度的定量关系,二者合称Lambert2Beer定律1.平面光波在各向同性的均匀媒质(溶液)中传播,定义A=ln(I0/I)为吸光度,其中I0和I分别是入射光和出射光的光强(I=I0e-Cl),则Beer定律的另一数学形式为:A=Cl,其中为常数,2C为溶液浓度,l是样品的厚度.当溶液浓度很大时,分子间的相互影响不可忽略,Beer定律不成立.有机

3、化合物的紫外2可见吸收光谱,是化合物中外层电子(包括成键电子和非成键电子)跃迁的结果,故又称电子吸收光谱3,4.光合作用是地球上最重要的生物化学反应,其作用是吸收太阳辐射并将其转化成绿色植物的生物能.太阳光在可见光区的强度最大(对应于6000K黑体辐射的强度峰值),经过漫长的自然选择,作为光合作用.本文a和b晶体的,并对其吸收曲线进行了分析和研究.2实验仪器简介WGD26型光学多通道分析仪2由光栅单色仪、CCD接收单元、扫描系统、电子放大器、A/D采集单元和计算机组成,如图1所示.入射狭缝、出射狭缝均为直狭缝,宽度范围为02mm连续可调.溴钨灯光源发出的光束通过宽度为10mmM1.反射镜M2.

4、准光镜M3.物镜M4.转镜G.平面衍射光栅S1.入射狭缝S2.CCD接收位置S3.观察窗或出射狭缝图1WGD26型光学多通道分析仪原理示意图收稿日期:2005203222;修改日期:2005208211资助项目:国家理科人才培养基地资助项目作者简介:刘畅(1982-),男,广东广州人,中山大学物理学系2002级物理学专业本科生.通讯联系人:卢东昱(1980-),男,广东揭阳人,中山大学硕士研究生.© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期刘畅,等:利

5、用光学多通道分析仪与分光光度计测定叶绿素的紫外2可见光区吸收光谱表1光合色素在有机溶剂中的吸收峰位置叶绿素种类叶绿素a叶绿素b2胡萝卜素2胡萝卜素叶黄素峰值/nm420,660435,643420,440,470425,450,480425,445,47539(l=10mm)的有机玻璃比色皿吸收池,进入入射狭缝S1,通过M1反射的光束经M2反射后成为平行光束投向光栅摄谱仪G.光栅摄谱仪采用反射式平面闪烁光栅作色散元件,拍摄原子或分子光谱.经G衍射后的平行光束经物镜M3成像在S2上.M2和M3镜焦距均为302.5mm,光栅G每毫米刻线600条,闪耀波长550nm.3检测步骤与样品制备1)用汞灯的

6、发射光谱对光学多道分析仪定丙酮提取液中色素浓度计算公式5如下Ca=12.21A663-2.81A646Cb=20.13A646-5.03A663CT=Ca+Cb=17.32A646-7.A663CX.C=(000A470-3.aCb)/229标.用以定标的汞灯发射谱线数据如下:红光区的定标起始波长为574nm,定标发射谱线分别是576.96nm,578.97nm和730.96nm;蓝紫光区的定标起始波长为400nm,定标发射谱线分别是404.67nm,435.83nm和546.07nm.2),吸收光谱的测量(6析仪).其叶绿素的提取方法是5:a.取新鲜的、洗净擦干的黄连翘叶片0.5g,去中脉,

7、剪碎后放入研钵中,加石英砂和碳酸钙粉(少量)及23mL80%丙酮(或95%乙醇),冰浴中研磨至组织变白,再加丙酮10mL,研成匀浆,暗处静置约10min.b.将提取液过滤到50mL棕色容量瓶(或替代物)中,用丙酮反复冲洗研钵与研棒数次,并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣,直至无绿色为止,以使色素全部转移入容量瓶.最后用丙酮定容至50mL,摇匀,保存于暗处备用.在进行光度测量时,使用参比溶液可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差,并扣除干扰的影响.作为简化实验,我们不采用显色剂,故参比溶液采用含有与待测溶液相同摩尔浓度溶剂的无色溶液1.3)把叶绿素晶体溶解在丙酮溶液中,对此溶液进行

8、吸收光谱的测量,比较所得结果(使用TU21800SPC型紫外2可见分光光度计).(1)a,Cb,T和b,-1CL-1;A663,A646,A470分别663nm,646nm,470nm下的吸光度.1)探测叶绿素提取液在整个可见光波段的吸收曲线(使用WGD26型光学多通道分析仪)探测的结果见图2,图中纵坐标值的计算公式为(适用于图24).y=100A=100ln,即A=ln)I(I()是入射光通过80%丙酮溶液后的光强式中I0()是入射光通过叶绿素丙酮溶液后的光强值,I(值,A是叶绿素在该波长的吸光度.由图2可得出,在红光区,吸收峰位于662.1nm处,该处的吸光度为A662=0.741.蓝紫光

9、区的吸收峰有3个:442.0nm,458.6nm和474.5nm,其中以474.5nm的吸光度最大,为4实验结果与讨论各种光合色素在有机溶剂(包括80%丙酮溶液)中的吸收峰位置3如表1所示.图2叶绿素提取液在可见光区(380740nm)的吸收光谱© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 40物理实验第25卷A474.5=0.574.(表示2次测量值的平均数)对照表1和式(1)的精确测量峰值表及各种叶绿素含量的计算公式,笔者认为:a.实测的662nm强吸收峰正

10、是叶绿素a在660nm3(或663nm5)的吸收峰,叶绿素b在643nm3(或646nm5)的吸收峰在被测溶液中没有被测量到.b.吸收峰442.0nm,458.6nm,474.5nm有可能是2胡萝卜素、2胡萝卜素和叶黄素吸收峰累加后的结果,其中442.0nm,474.5nm两峰与2胡萝卜素的440nm,470nm3和叶黄素的445nm,475nm3峰值比较一致.c.由式(1)计算,实验用的黄连翘叶子的色素(a)红光区(580730nm)含量如表2所示.表2mg/L-浓度CaCTCX.C7.3.3911.140.74(b)蓝紫光区(350500nm)注:叶绿素a和b的含量比约为73.图3叶绿素提

11、取液的分浓度吸收光谱2)探测不同浓度的叶绿素提取液在吸收峰附近的吸收曲线(使用WGD26型光学多通道分析仪)为了测出叶绿素提取液的浓度对吸收峰的影响,对不同浓度的叶绿素提取液在吸收峰附近的吸收曲线进行了探测.假设提取液的起始浓度为100%,然后采用逐次稀释的方法测出浓度为50%,25%,10%时溶液的吸收曲线.测得的2个主要吸收峰(662nm和436nm)的吸光度随浓度变化的曲线见图3.可以看出,溶液的浓度对吸收峰的波长几乎没有影响,光的吸收与溶液浓度的关系遵从Lambert2Beer定律.3)探测叶绿素晶体在可见光与近紫外光区的吸收曲线(使用TU21800SPC型紫外2可见分光光度计)为了将

12、实验所得的曲线与标准值比较,使用了叶绿素a(Fluka,纯度95%)和叶绿素b(Fluka,纯度95%)配制的丙酮溶液进行测量,并将测得的吸收曲线与提取液的吸收曲线进行了比较.实验采用叶绿素a为0.24mg(使用BP221D电子天平称取)与纯丙酮(>99.5%)试剂配制成50mL的4.8mg/L叶绿素a2丙酮溶液,以TU21800SPC型紫外2可见分光光度计探测紫外2可见光区的吸收曲线.然后使用叶绿素b的丙酮溶液(约4mg/L,在低于4的环境下保存)重复上述测量.探测结果如图4所示.图中叶绿素b的吸光度为实测的1/3.测得的叶绿素a和叶绿素b的吸收峰如表3所示.图4叶绿素a和b2丙酮溶液

13、在可见光及近紫外区(300750nm)的吸收光谱© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期刘畅,等:利用光学多通道分析仪与分光光度计测定叶绿素的紫外2可见光区吸收光谱表3叶绿素a和叶绿素b的吸收峰41吸收峰应位于456nm处.而且叶绿素a2丙酮溶液的蓝紫光区吸收峰也不位于420nm,而应是431nm.至于红光区的吸收峰,实测值与文献数据相吻合.叶绿素a(4.8mg/L)/nm662431411382A叶绿素b(约4mg/L)/nm645456337A

14、0.3860.4660.3320.2160.9632.4030.6745结束语用分析化学中常用的吸光光度法对叶绿素提取液和叶绿素晶体进行了初步的分析和研究,结果表明叶绿素在红光和蓝紫光区有一系列的吸收峰,因而能有效地吸收太阳辐射,使之转化为绿色植物的生物能.进一步研究的方向是通过分离叶.致谢:,!把精测的吸收曲线图4与自行提取的叶绿素的吸收曲线图2作对比,有以下值得注意的地方:a.在叶绿素提取液中的红光吸收峰只有662nm,叶绿素b的645nm吸收峰不明显.这可能是由于黄连翘叶片中叶绿素a和b的含量比约为73,叶绿素b的吸收峰被掩盖在叶绿素a的662nm强峰之下.b.精测的2都大于红光区,.c

15、.提取液中蓝紫光区的峰值位置与叶绿素a和b的吸收峰位置均不一致,这是因为天然的植物叶子不可避免地含有多种植物色素,多种成分的植物色素的吸光性能叠加后,峰值点偏离了原来位置.把图4与表1中峰值比较,由于TU21800SPC型紫外2可见分光光度计的测量误差不应达到20nm,笔者认为文献中的数据存在争议.叶绿素b2丙酮溶液在435nm处不存在吸收峰,参考文献:1武汉大学.分析化学M.北京:高等教育出版社,2000.2中山大学物理科学与工程技术学院.基础物理实验(创新性实验部分)Z.2004.3严国光,周佩珍,郭础,等.光合作用原初过程M.北京:科学出版社,1987.4罗庆尧,等.分光光度分析M.北京

16、:科学出版社,1992.5王英典,刘宁.植物生物学实验指导M.北京:高等教育出版社,2001.MeasurementofUV2VisabsorptionspectraofchlorophyllbyusingOMAandspectrophotometerLIUChang,WANGShi2cai,LUDong2yu(DepartmentofPhysics,SunYat2SenUniversity,Guangzhou510275,China)Abstract:Spectrophotometry,atypicalmethodinanalyticalchemistry,isusedinthispapertomeasureUV2Visabsorptionspectraofchlorophyllextractingliquidandcrystal.Andopticalmulti2channelanalyzerandspectrophotometerareusedalso.Theabsorptioncurveofchlorophyllisana2lyzed.Theexperimentcanconvenientlybeappliedtoexperimentteachingofphysics,chemistryandjun