人大隐静脉器官培养内膜增生形态学研究

1、    人大隐静脉器官培养内膜增生形态学研究        【摘要】目的观察人大隐静脉在器官培养条件下是否发生内膜增生。方法取30条人大隐静脉段进行器官培养14d，冰冻切片，苏木素-伊红(HE)、弹性纤维染色以及抗-肌动蛋白(-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色，与不培养的对照组进行组织形态学比较。结果培养14d后内膜显著增厚，增厚内膜层中细胞为平滑肌细胞，增殖率为45%。结论体外培养的人体大隐静脉将出现内膜增生。内膜增生是由于中层平滑肌细胞向内膜层的移

2、行和增生，这与人大隐静脉旁路移植术后病理改变相同。【关键词】人大隐静脉；器官培养；内膜增生 Morphologic studies on endometrial hyperplasia of human saphenous vein in organ cultureWANG Yuqi, DAI Wangde, FU Weiguo, et al. Research Unit of Vascular Surgery, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China【Abstract】 Objective

3、 To investigate endometrial hyperplasia of human saphenous vein under the condition of organ culture. Methods Thirty saphenous vein segments were cultured for 14 days, frozen in liquid nitrogen and processed for Harris' hematoxylin and eosin and miller's elastic stain, as well as immunohisto

4、chemistry. Immunostaining of the frozen sections was performed with monoclonal anti-smooth muscle -actin and anti-PCNA antibody. Freshly excised vein segments were processed similarly as a control group. Results Human saphenous vein intimal thickness was increased significantly after cultured for 14

5、 days. The cells within neointima were smooth muscle cells (SMCs) with the proliferating index of SMCs within neointima being 45 %. Conclusion Endometrial hyperplasia of human saphenous vein in the organ culture might result from migration of medial SMCs into the intima and from proliferation.【Key w

6、ords】 Human saphenous vein; Organ culture; Endometrical hyperplasia为探讨人静脉内膜增生的发生机理，Soyombo等1于1990年建立了人大隐静脉器官培养内膜增生实验模型。我们对其加以改进，使方法更简便易行，观察到了同样的内膜增生，现报道如下。材料与方法1.材料：(1)组织转送液配制：RPMI1640+20mmol/L HEPES+4000IU/L肝素+5mg/L二性霉素B。(2)组织清洗液配制： RPMI1640+20mmol/L HEPES+2.5mg/L庆大霉素+100mg/L青、链霉素+0.8mmol/L谷氨酰胺。(3)

7、组织培养液配制：RPMI 1640+2g/L NaHCO3+2.5mg/L庆大霉素+100mg/L青、链霉素+0.8mmol/L谷氨酰胺+体积分数为30%小牛血清。(4)台盼蓝液配制：pH7.4DPBS液中含质量分数为0.01%台盼蓝。2.器官培养所用气-液相界面系统制作：40目不锈钢丝网剪成1.5cm×2.0cm长方形，长的一方两端各折弯约0.4cm成直角，置直径为60mm培养皿中，其上覆盖擦镜纸，建立界面培养系统。3.人大隐静脉取材：选择病程短、曲张静脉局限于小腿、程度轻、无溃疡及色素沉着的下肢静脉曲张手术病例。取材部位在大隐静脉近股静脉入口处，长约3cm，用作培养的静脉段外观正

8、常，病理切片检查无内膜增生，共30例。4.器官培养步骤：(1)切取3cm长大隐静脉，置组织转送液内室温下立即送到组织培养实验室。(2)手术显微镜下去除外膜和脂肪组织，纵向剪开静脉，用细针从内膜面张开，冲洗去除血细胞和凝血块，用刀片以5mm间隔横断。这一阶段用作分析的静脉被视为新鲜分离的静脉。(3)一部分静脉片在质量分数为0.01%台盼蓝液中室温下温育12min，评价内皮细胞的完整性和活性，不作为器官培养材料。(4)在器官培养界面系统中加入组织培养液，液量以浸过擦镜纸为准。静脉片以内膜面置擦镜纸上。在37、体积分数为5%CO2培养箱内共培养14d，培养液23d更换1次。所有标本液氮保存备用。5.

9、检测指标及方法：(1)冰冻切片：液氮保存标本在LEICA CM1902恒冷箱切片机冰冻切片，片厚5m，切片置于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，干燥后用体积分数为100%丙酮固定5min备用。(2)常规苏木素-伊红(HE)和弹力纤维染色：每个静脉连续3张切片染色，用像分析系统对每张切片上不同3点进行内膜厚度测定。(3)抗平滑肌-肌动蛋白(-actin)的单克隆抗体免疫组织化学染色：冰冻切片固定后按免疫组织化学常规处理。TBS洗5min×3次。然后滴加体积分数为0.3%H2O2甲醇，室温下30min；TBS洗5min×3次，清洗后加120正常羊血清，室温保持15min以阻断非特异反应

10、；加特异性一抗(抗平滑肌-actin的单抗)37 60min后TBS浸洗5min×3次。再加1200稀释的酶标二抗，37 30min后TBS浸洗5min×3次，用ABC在37反应30，TBS浸洗5min×3次，DAB溶液显微镜下控制显色，在出现强的特异性显色而背景基本不着色时终止显色反应，苏木素盐酸复染，脱水，透明后用中性树胶封片。显色镜下呈棕褐色标记的细胞为平滑肌细胞。(4)PCNA免疫组织化学分析：冰冻切片免疫组织化学分析步骤同上，第一特异性单抗用鼠抗人PCNA单克隆抗体，核染色呈棕褐色者为增殖期细胞。(5)UEA-1亲合免疫细胞化学技术染色：冰冻切片常规处理

11、后在生物素结合的UEA-1中浸育60min，TBS染涤后再与ABC试剂浸育，DAB镜下控制显色，苏木素复染，再脱水，透明，中性树胶封片。显微镜下观察呈棕褐色标记的细胞为内皮细胞。(6)内皮细胞扫描电镜观察：标本在4下用体积分数为2%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)固定24h后，再用质量分数为1%饿酸固定2h，然后梯度乙醇脱水和临界点干燥喷金，在扫描电镜下比较培养前后内皮细胞变化。结果1.内皮细胞活力和表面形态：用台盼蓝染色和扫描电镜观察准备培养和培养14d后的内膜面完整性。准备培养的静脉台盼蓝着色部位靠近切口边缘，扫描电镜显示内皮细胞形态完整，有连续的内皮细胞层，静脉边缘细胞形态多变，有完整的内

12、皮细胞区，也有内皮细胞剥脱后内皮下结构暴露的区域。培养14d后的静脉内膜面无台盼蓝染色，扫描电镜显示中心区域与刚分离时相似，细胞间常有较大间隙。为进一步鉴别和定位内皮细胞，横断面切片用UEA-1进行亲合免疫细胞化学技术染色。新鲜静脉在未着色的中层上有1层内皮细胞单层，在中间部分是连续的，周围部分有间隙。培养后的静脉片内膜面主要由内皮细胞组成，间或有未着色细胞。2.内膜厚度和细胞成分：培养前后的静脉片冰冻切片HE、弹力纤维染色后进行像分析，测定各组内膜厚度。培养前内膜厚度为(3.5±2.0)m(n=30)，培养后内膜厚度为(47.0±9.3)m(n=30)，培养前后内膜厚度之

13、间的差异有非常显著性(P0.01)。切片抗平滑肌-actin的单抗免疫组织化学染色，培养后静脉片增厚内膜中细胞成分标记为棕褐色，证明为平滑肌细胞。而新鲜静脉切片中，大多数中层细胞标记显示为平滑肌细胞，很多未标记的细胞在外膜层中，而内膜层中没有标记的细胞。PCNA免疫组织化学检查发现培养14d后静脉新内膜中的平滑肌细胞的细胞核增殖抗原染色阳性，染色率达45%，表明增厚内膜中平滑肌细胞增生活跃。讨论本实验结果显示，大隐静脉离体培养14d后均发生内膜增生，增厚的内膜是由中层平滑肌细胞向内膜层移行和增殖而成。我们在此模型中观察到的平滑肌细胞移行和增生现象的机理可能为：(1)已知内皮细胞能通过分泌功能抑

14、制或促进内膜增生的因子调节平滑肌细胞的移行和增生2。如果在培养条件下这种内皮细胞来源的抑制因子产生减少，而促进内膜增生的因子增加，静脉管壁内膜局部内皮源性生长因子相对浓度则高，就产生了浓度梯度。内膜局部抑制内膜增生因子浓度降低，促进内膜增生因子浓度则增加，引起中层平滑肌沿浓度梯度向内膜层移行和增生。这可能是平滑肌细胞向内膜移行和增生的原因。(2)有实验证明，中层平滑肌细胞相互之间的接触或与细胞外基质成分的接触可抑制平滑肌细胞的分裂增生2。静脉移植后以及器官培养时静脉内膜面这种抑制作用可能下降，导致平滑肌细胞向内膜移行和增生。基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670685)作者单位：王玉琦（200032上海医科大学中山医院血管外科研究室）代望德（200032上海医科大学中山医院血管外科研究室）符伟国（200032上海医科大学中山医院血管外科研究室）姚秀玲（200032上海医科大学中山医院血管外科研究室）参考文献1，Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in an or