大麦黄矮病毒MP原核表达实验方案

1、前期准备工作1. 设计的构建pET-28a(+)-MP载体引物两端都带有His标签 ：MP-ET28a-DF: 5-CGCGGATCCATGGCACAAGAAGG-3 Tm：66.3 GC%: 60.9% (BamHI)MP-ET28a-DR: 5-CCCAAGCTTTCGTTGATTCCTGGaattc-3 Tm：65.1 GC%: 46.4% (Hind)只有前端带有His标签： MP-ET28a-SF: 5-CGCGGATCCATGGCACAAGAAGG-3 Tm：66.3 GC%: 60.9% (BamHI)MP-ET28a-SR: 5-CCCAAGCTT TCATCGTTGATTCC

2、TGG-3 Tm：64.7 GC%: 50% (Hind)2. 划线摇菌提取pET-28a(+)质粒实验流程一、 pET-28a(+)-D MP及pET-28a(+)-S-MP载体构建方案一： 表达融合蛋白两端均带有His标签的pET-28a(+)-D-MP载体的构建根据已构建好带有BYDV-MP ORF序列的质粒为模板，以MP-ET28a-DF / MP-ET28a-DR为引物，扩增MP cDNA序列。主要过程如下：PCR产物与载体pET-28a(+)分别通过BamHI/ Hind 进行双酶切，回收酶切产物，连接转化大肠杆菌。经PCR和 双酶切验证后测序，分析测序结果，将含有正确插入片段的重

3、组质粒定名为pET-28a(+)-D-MP。1. PCR扩增目的片段10Golden Taq Reaction Buffer2.5ldNTP0.5lMP-ET28a-DF0.5lMP-ET28a-DR0.5lGolden Taq DNA polymerase0.2l质粒模板0.2lddH2O20.6l25.0lPCR反应条件：94 5min；94 30s，64 30s，72 30s，30个循环；72延伸10min；16保温2. PCR产物的纯化将PCR产物置于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，电泳缓冲液为1TAE。电泳结束后将凝胶于10g/l溴化乙锭中染色5min，于Alpha凝胶成像仪中观察并记

4、录结果。从凝胶中切下目的片段，使用胶回收试剂盒回收目的片段。 3. 酶切回收到的PCR产物以及pET-28a(+)载体回收产物15ul pET-28a(+)10ul10K buffer5ul 10K buffer5ulEcoR I1ul EcoR I1ulBamH I1ul BamH I1ulddH2O28ul ddH2O33ul50ul 50ul37 过夜4. 酶切产物回收将酶切后的产物利用PCR产物直接回收试剂盒进行回收。5. 连接反应片段2ul载体6.5ulT4 Ligase0.5ulBuffer1ul10ul16 过夜6. 连接产物转化大肠杆菌（1）将100l大肠杆菌感受态细胞置于冰上

5、融化；（2）加入10l连接产物，轻轻搅动以混匀内容物；（3）将混合物于冰上放置30min，然后42水浴热激90s ；（4）冰上放置5min；（5）加400l LB培养基（不含抗生素），混匀；（6）37，150rpm振荡培养45min；（7）吸取适当体积的菌液涂布于LB琼脂平板（含60g/ml的卡那青霉素）上，在超净台内吹干；（8）37倒置培养16-20 h。7. 碱裂解法提取质粒DNA（1）接一单菌落于5ml灭菌的LB培养基中，37剧烈振荡培养16 h；（2）取1.5 ml培养物倒入微量离心管中，于4以12000g离心30 s，沉淀中加入100l GTE溶液（50 mmol/L葡萄糖；25 m

6、mol/L Tris-HCl，pH 8.0；10 mmol/L EDTA，pH8.0），在涡旋混合器上剧烈震荡，使之重新悬浮起来，于室温静置5min；（3）加入200l NaOH/SDS（0.2 mol/L NaOH; 1% SDS）溶液，混匀，于冰上放置5min；（4）加入150l乙酸钾溶液（5 mol/L, pH4.8），轻微振荡，于冰上放置5min；（5）于4以12000 g离心5 min，然后将上清液移到另一离心管中，加入2倍体积的95%乙醇，于室温静置2min；（6）于4以12000g离心5min，用1ml 70%乙醇洗涤沉淀，然后真空干燥；（7）用30l含25g/ml RNaseA

7、的ddH2O溶解核酸，-20保存。8. 酶切验证重组质粒pET-28a(+)-D-MP2.5ulEcoR I0.3ulBamH I0.3ulddH2O5.9ul10ul 37 过夜 酶切出目的片段的阳性克隆，送去测序。构建成功的质粒命名为pET-28a(+)-D-MP。方案二 表达融合蛋白前端带有His标签的pET-28a(+)-S-MP载体的构建载体构建方法同方案一，仅改变PCR反应条件。PCR反应条件：94 5min；94 30s，63 30s，72 30s，30个循环；72延伸10min；16保温。 酶切出目的片段的阳性克隆，送去测序。构建成功的质粒命名为pET-28a(+)-S-MP。

8、二、IPTG诱导表达及表达产物的检测1IPTG诱导表达 将pET-28a(+)-D-MP与pET-28a(+)-S-MP质粒分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落于3 ml LB液体培养基中（含氨苄青霉素100mg/ml），37振荡培养过夜，同时将经测序验证含有正确读码的重组质粒BL21菌株进行振荡培养，然后分别按1：100稀释到新鲜的LB液体培养基中（含卡那青霉素100mg/ml），37振荡培养至OD600达到0.41.0（3小时左右），取出1ml菌液作为诱导前的对照（离心收集菌体，加入1/10体积即100ml蒸馏水，震荡悬浮，再加入1/10体积即100ml 2SDS凝胶加样缓冲液，

9、100煮沸5min，-20保存以备SDS-PAGE分析用），然后加入IPTG至终浓度为1mM，选择28、4h、6h、8h不同的时间段和37 4h进行摇培，取出1ml菌液，处理方法与诱导前的对照菌液的处理相同。经10的SDS-PAGE分析确定最佳诱导时间后，即可大量诱导用于纯化蛋白。2 原核表达产物的SDS-PAGE样品的制备：离心收集，加入100 l样品缓冲液（50mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0），震荡悬浮，加入等体积即100 l的2凝胶上样缓冲液（0.1M Tris-HCl，pH 6.8，0.2M DTT，4SDS， 0.2溴酚蓝，20甘油），100煮沸5min

10、，-20保存以备SDS-PAGE分析用。材料与试剂：30丙烯酰胺溶液（29丙烯酰胺和1N，N-亚甲基双丙烯酰胺，pH7)10SDSTEMED原液（N，N，N，N-四甲基乙二胺)10过硫酸胺1Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris,，250mM甘氨酸,，0.1SDS, pH8.3)考马斯亮兰R250染色液（45甲醇，10冰乙酸，0.25考马斯亮兰R250)脱色液（45甲醇，10冰乙酸)Tris-HCl（pH 8.8, 1.5 M ) 分离胶储备液Tris-HCl（pH6.8, 1M) 浓缩胶储备液转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM甘氨酸，20%甲醇，pH8.3)TBS（20

11、 mM Tris，pH 7.5；150 mM NaCl)、TBST（含0.05% Tween 20的TBS)封闭液（5%的脱脂奶粉溶于TBS）抗体稀释液（含5%脱脂奶粉的TBST)底物缓冲液（100mM NaCl, 5mM MgCl2, 100mM Tris-HCl, pH9.5)SDS-PAGE步骤：1) 安装电泳槽前，将玻璃板、胶条、梳子洗净，用酒精擦拭，晾干；2) 安装好模子后，配好15%下层分离胶，立即将胶沿玻璃棒缓缓注入模子中，过程中防止产生气泡，胶液加至距模子玻璃板面距离顶部3cm 即可，迅速用滴管在胶液上覆盖一层水，垂直静止聚合30 min。待胶与水层之间形成清晰的界面时，将水倒

12、掉，将配好混匀的15%上层浓缩胶倒入下层分离胶上面，并插入梳子。静止聚合40min，取出梳子，即完成了凝胶准备；3) 将电极缓冲液倒入样品槽内外加满；将蛋白Marker 及处理好的样品（各20 l)分别注入孔中。4) 接通电源，初电压为80 V/cm，当样品进入分离胶后将电压调至120V/cm，整个过程维持电压不变，当电泳到底边1cm处停止电泳；5) 将模子取下，小心将胶移到大培养皿中，用蒸馏水稍稍冲洗后，加入考马斯亮兰R250染色液，在摇床上摇动染色2h；6) 将胶中加入脱色液，在摇床上脱色至条带清晰为止（Sambrook et al., 1989)。蛋白纯化回收：原核表达蛋白纯化采用切胶回

13、收的方法，IPTG诱导后，菌液收集进行SDS-PAGE。电泳完毕后取下凝胶，用预冷的染色液（0.25M KCl，1 mM DTT）浸泡510min，至出现白色的蛋白条带，切下所需的目的条带，加入等体积的生理盐水溶液（0.8 % NaCl）于冰浴中研磨，4放置过夜。12,000 g离心10min，收集上清。SDS-PAGE确定是否得到目标蛋白后紫外吸收法测定蛋白含量，将回收到的蛋白溶液用生理盐水适当稀释，经超微量分光光度计NanoDrop 2000测定蛋白含量，约在4.0ng/ul，满足注射兔子的含量。三、MP多克隆抗血清制备1免疫大白兔制备抗血清以原核表达的蛋白为免疫原，采用肌肉和皮下注射相结

14、合的方法免疫獭兔。每次注射前将免疫原蛋白溶液与等体积的福氏不完全佐剂（Sigma）在磁力搅拌器上混合至乳化完全（滴一滴乳化液至水面，能持续片刻不散开表明乳化完全）。具体免疫方法是：首先第一周耳静脉取血2ml 制备少量正常血清，然后在兔子后腿肌肉注射2/3量的免疫原，背部皮下注射1/3量免疫原，免疫剂量约为0.2mg，第二、三、四周相同部位加强免疫，每次免疫剂量约为0.1mg。第五六周耳静脉取血，测效价，制备抗血清。将采集到的血液室温下凝固后，置于37温箱中1h，用解剖刀沿烧杯边缘轻轻剥离凝血块，4冰箱过夜，吸出析出的血清，3000 rpm离心10 min，上清液即为无红血球的澄清抗血清，按1/1000量加入NaN3防腐，无菌分装后密封-80保存。2Western blotting1) SDS-PAGE后的凝胶在转移缓冲液中漂洗后，用电转移仪转移至硝酸纤维素膜上（4，100V，1h）；2) 将膜置于封闭液中，室温摇床上封闭2h或4封闭过夜；3) 封闭后的NC膜在TBST中漂洗三次，每次10 min。加入用TBST稀释的抗血清（1：5