慢性胃炎脾胃湿热证与Hp感染、NF-КB、TGF-α表达及G、D细

1、慢性胃炎脾胃湿热证与Hp 感染、NF-B 、TGF-表达及G、D细胞的相关研究专 业：中西医结合基础 研究生：任 彦导 师：武一曼 副 教 授摘 要目的：探讨慢性胃炎脾胃湿热证与幽门螺杆菌（Hp）感染、核转录因子-kappaB（NF-B）、转化生长因子-alpha（TGF-）表达及分泌胃泌素的G细胞、分泌生长抑素的D细胞之间的关系。方法：慢性胃炎患者58例，其中符合中医脾胃湿热组33例，脾胃气虚组25例，正常对照组11例，所有受试者均行胃镜检查，胃窦部活检标本行快速尿素酶试验及Hp染色检测Hp，NF-B、TGF-和G、D细胞免疫细胞化学染色，并比较分析它们的相关性。结果：1. 脾胃湿热组的Hp

2、感染率（72.73%）高于脾胃气虚组（24%）（P<0.01）。2. 正常对照组胃粘膜内NF-B和TGF-呈弱表达。慢性胃炎患者胃粘膜内NF-B和TGF-表达增强。脾胃湿热组NF-B和TGF-呈高表达，比脾胃气虚组和正常组表达增强，且有显著性差异（P<0.05和P<0.01）。G细胞和部分腺上皮的细胞核内NF-B也呈高表达。TGF-常以颗粒状的特征位于腺上皮细胞核上区呈高表达。 3. 脾胃湿热组G细胞数量与脾胃气虚组和正常对照组相比无显著性差异（P>0.05）；但脾胃湿热组D细胞数量则显著低于其它两组（P<0.01），G/D细胞比值脾胃湿热组也高于其它两组（P&l

3、t;0.01）。 结论： 1. 慢性胃炎脾胃湿热证患者有较高的Hp感染率。2. 慢性胃炎脾胃湿热证NF-B和TGF-的表达较脾胃气虚组和正常对照组增强。NF-B和TGF-二者的表达平行且呈正相关，Hp可激活NF-B并在诱导炎症因子表达和扩大炎症反应中起重要作用，大量浸润的炎症细胞又可分泌TGF-，可能是该证多与活动性炎症相关的微观机制之一。3. 慢性胃炎脾胃湿热证和脾胃气虚证比较，D细胞数减少，G/D细胞比值增大，与Hp介入有关。Hp可抑制胃窦D细胞生长抑素的合成和D细胞的增殖，从而可能减少D细胞对G细胞胃泌素分泌的抑制。因而慢性胃炎脾胃湿热证G细胞数量虽无明显变化，但胃泌素增高。4. Hp是

4、致癌原，TGF-和G细胞分泌的胃泌素都能促进细胞增殖，NF-B可抗细胞凋亡，胃泌素可诱导NF-B的激活，TGF-可促进胃泌素的表达，脾胃湿热证患者以上指标均有较高表达，而D细胞减少，对以上因素均起抑制作用的生长抑素分泌减少，可能影响慢性胃炎脾胃湿热证的转归预后，具体机制需进一步研究。5. NF-B、TGF-和G/D细胞比值作为检测慢性胃炎脾胃湿热证病情的发展指标可能有一定的临床意义。主题词： 胃炎/诊断 慢性病 脾胃湿热 螺杆菌感染/微生物学 NF-B/血液 转化生长因子-/血液 G细胞/生理学 D细胞/生理学 免疫细胞化学/方法Study on Helicobacter Pylori Inf

5、ection、Expression of NF-B 、TGF-and G, D Cells In Chronic Gastritis Patients with Spleen-stomach Damp-heat Syndrome Major： Basis of Integrated Traditional Chineseand Western MedicinePostgraduate：Ren YanTutor： Associate Professor Wu Yi manABSTRACT Objective: To investigate Helicobacter Pylori infectio

6、n、expression of Nuclear Factor-kappa B （NF-B）、Transforming growth factor-alpha(TGF-) and G、D cells presented in gastric antral mucosa of chronic gastritis patients with spleen-stomach damp-heat syndrome and study the correlation between them. Method: 58 chronic gastritis patients were selected as re

7、search subjects. According to the differentiation standards of chronic gastritis of TCM,33 cases belonged to spleen-stomach damp-heat (SSDH) group,25 cases belonged to spleen-stomach qi-deficiency group,and 11 healthy persons as control group. Antral mucosal biopsies were obtained during endoscopy i

8、n these patients and in controls with intact mucosa. Rapid urease tests and H.pylori staining were used for the diagnosis of H.pylori.Immunocytochemical technique was used to study the expression of NF-B、TGF-and G、D cells,and the correlation between them.Result:1. H.pylori infection ratio was high（7

9、2.73%）in the SSDH group than in the SSQD group（24%）(p<0.01). 2. NF-B and TGF-expressed weakly in the control group, while expression of NF-B and TGF-in the gastritis group was upregulated, especially in the SSDH group, expression of NF-B and TGF-was higher than that in SSQD group or in control gr

10、oup (p<0.05, p<0.01). Moreover, NF-B expressed frequently in the G cells and nuclei of some grandular epithelia. As a granular character, TGF-located frequently in the upernuclear region, and appeared strong expression. 3. The results indicated that the number of G cells was not obviously diff

11、erent in the three groups (P>0.05).The D cells in the SSDH group were greatly decreased, and there was significant difference. (P<0.01) Compared with other two groups, simultaneously, the G/D ratio of the SSDH group was increased.Conclusion:1.The chronic gastritis patients with SSDH syndrome h

12、ave high H.pylori infection ratio.2.The expression of NF-B and TGF-in the gastritis group was increased, and the SSDH group was much higher than that of other groups. The expression of NF-B observed paralleled to TGF-and existed a positive correlation between NF-B and TGF-. H.pylori activates the tr

13、anscription factor NF-B and this event plays a central role in the induction and enhancement of the inflammatory reaction.Simultaneously, the large infiltrates of inflammatory cells secrete TGF-.This suggests a possible mechanism that the SSDH syndrome correlated well with the activity of gastritis.

14、3. The D cells in the SSDH group were greatly decreased. Compared with other two groups, simultaneously, the G/D ratio of the SSDH group was increased. All of the results perhaps associated with the infection of H.pylori, which inhibited the synthesis of somatostatin and D cell proliferation. Thus t

15、he D cell probably reduced the effect to inhibit of gastrin secretion from G cells.Thus although the number of G cells was not obviously different in the SSDH group, whose gastrin was increased.4. H.pylori is a carcinogen, TGF-and gastrin, which is secreted by G cell,promote the proliferation of cel

16、ls,and NF-B plays an important role in the protection of cells from apoptosis.Gastrin induces activation of NF-B,and TGF-increases transcription of the gastrin gene.All of the above was highly expressed in the SSDH patients,whose D cells were deficient, thus the secretion of somatostatin,which can i

17、nhibit the above role,was decreasd. This event eventually influenced the procedure of chronic gastritis with SSDH syndrome.The exact mechanism was still not clear.5. It was perhaps important to detect NF-B、TGF-and G/D ratio periodically in SSDH patients for clinical monitoring the inflammation proce

18、dure.Key Words: gastritis/diag chronic disease spleen-stomach damp-heat Helicobacter pylori Infections/microbiol NF-kappa B/blood Transforming growth factor-alpha/blood G cells / physiology D cells / physiology Immunohistochemistry/methods 慢性胃炎脾胃湿热证与Hp 感染、NF-B 、TGF-表达及G、D细胞的相关研究专 业：中西医结合基础 研究生：任 彦导

19、师：武一曼 副 教 授前 言INTRODUCTION 胃炎是我国普遍存在的消化道常见疾病，是胃粘膜对损伤的炎症反应。慢性胃炎（chronic gastritis）是主要由幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）所引起的胃粘膜慢性炎症，常在儿童期受感染，随年龄增长发病率亦增高，多数是以胃窦为主的全胃炎，即慢性胃窦炎（B型胃炎），后期以胃粘膜固有膜腺体萎缩和肠腺化生为主要病理特点，其临床表现无特异性，病程迁延，可有中上腹不适，饱胀、隐痛，无明显节律性，嗳气，泛酸，食欲不振，恶心等消化不良症状较常见，部分患者有Hp感染而无明显症状，诊断主要依靠胃镜和胃粘膜活检组织学检查。慢性胃体炎

20、（A型胃炎）发生在自身免疫基础上，遗传因素参与发病，我国少见。本课题研究对象为B型胃炎。1 祖国医学对慢性胃炎脾胃湿热证的认识1.1慢性胃炎与脾胃湿热证的关系慢性胃炎归属于中医学“胃痞”、“胃脘痛”、或兼“反酸”、“嘈杂”范畴。400例脾胃湿热证临床调查显示该证与消化系统关系密切，慢性胃炎湿热证占52.38%，慢性胃炎Hp(+)占53.27%，湿热证Hp(+)占69.75%。1表明湿热邪气-慢性胃炎-湿热证Hp(+)相互间关系密切，是最为常见的临床证候类型。1.2慢性胃炎脾胃湿热证的病因病机李杲脾胃论曰：“夫脾者阴土也”，喜燥恶湿，主运化升清，脾病则精微不布，蕴而生湿；“胃者阳土也”，喜润恶燥

21、，主受纳腐熟水谷，胃病则通降不行，郁而生热。脾胃乃易虚易实之脏腑，每为饮食所伤，或为六淫所感，情志所累。我省地处东南沿海，温暖多雨，属亚热带湿润季风气候，湿热之邪容易为患。叶天士在外感温热论中指出：“湿邪害人最广外邪入里，里湿为合，在阳旺之躯，胃湿恒多；在阴盛之体，脾湿亦不少，然其化热则一。”指阳气旺盛的人感湿邪，易从热化、燥化，病变侧重阳明，即“胃湿”，而阴盛之体，指阳虚之人感湿邪，易邪从寒化、湿化，侧重足太阴脾，即“脾湿”。清代薛生白湿热病篇也指出：“湿热病属阳明太阴经者居多，中气实则病在阳明，中气虚则病在太阴。”即偏湿偏热，决定于感受之邪以热邪为主还是以湿邪为主，还决定于人身阳气之盛衰。

22、湿热邪气含阴阳二性，脾胃亦一阴一阳，因而湿热易在脾胃滋生和盘踞。正如章虚谷所说：“湿土之气同类相召，故湿热之邪始虽外受，终归脾胃。”湿热为病，由气化失常向形质损伤渐变。湿热中阻，既为痰浊之源，又阻滞气机流通。脾失运化，胃受纳、腐熟、通降等气化功能不利，则症见痞满纳呆、嗳腐反酸、舌苔黄腻、大便溏等症候。“邪之所凑，其气必虚”，久之脾胃气阴日虚，痰浊内停、血行不畅、瘀阻胃络，迁延不愈甚至渐成有形之积。2 现代医学对慢性胃炎的认识2.1 慢性胃炎的病因和发病机制2.1.1幽门螺杆菌（Hp）感染 Hp感染是慢性胃炎的主要病因，已被世界卫生组织列为胃癌的I类致癌危险因素2。Hp通过污染的水和食物经粪-口

23、或口-口途径感染。Hp感染率在发展中国家一般为50%-80%，感染率随年龄增长而升高。2.1.2 其他因素由于幽门括约肌功能不全,十二指肠内容物胆汁、肠液、胰液反流入胃，削弱胃粘膜屏障功能，产生炎症、糜烂和粘膜上皮反应性变化。长期摄食粗糙性、刺激性食物、过热饮料、嗜酒、咸食、长期服用非甾体类抗炎镇痛药等长期反复损伤胃粘膜造成炎症持续不愈，或与Hp协同作用导致多灶性萎缩。2.2 慢性胃炎与细胞因子细胞因子是由免疫细胞如单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和某些非免疫细胞如血管内皮细胞、表皮细胞以及成纤维细胞经刺激而合成和分泌的一类有促进细胞生长、增殖、合成作用的蛋白质或多肽，属于自分泌和旁分泌范畴，和

24、效应细胞上具有高亲和力的受体结合，诱导靶细胞增殖、分化和功能的增减变化。根据功能分三类：炎症性细胞因子、免疫调节细胞因子和生长因子。在胃肠道炎症中都有上述细胞因子参与，并直接影响炎症反应的进程。核转录因子Kappa B（NF-B）在炎症因子诱导下，可迅速激活编码各种参与炎症、感染、应激等细胞反应的目的基因，调控炎症、免疫和急性期反应的进程，较其他炎症因子如：IL-1、肿瘤坏死因子-alpha(TNF-)等更能准确地反映炎症水平3。转化生长因子-alpha（TGF-）与胃肠道慢性炎症密切相关4。2.3 慢性胃炎与胃肠激素胃肠道的消化吸收功能有赖于中枢神经系统（central nervous sy

25、stem,CNS）、自主神经系统和肠神经系统（enteric nervous system,ENS）的完整与协调。ENS处于CNS-ENS-消化器官靶组织轴的中心地位。生长抑素、胆囊收缩素等均可由肠神经元分泌。此外，胃肠道多种内分泌细胞也合成胃肠激素，或以自分泌对自身分泌细胞，或以旁分泌对邻近细胞，或以内分泌通过血循环作用于远处靶细胞发挥调节功能。免疫组织化学是唯一能肯定分泌细胞及其激素分泌的方法。胃窦部G细胞分泌胃泌素，D细胞分泌生长抑素，在协调维持胃酸的正常分泌中起重要作用。G、D细胞数量和比值的变化，是反映胃炎病理改变的客观指标5。2.4 慢性胃炎与胃癌 慢性胃炎与胃癌的关系密切，Cor

26、rea指出胃癌发病的多阶段模式：自慢性浅表性胃炎依次演变为慢性萎缩性胃炎、肠化生、异型增生和腺癌。而慢性胃炎的主要致病因素Hp已被世界卫生组织（WHO）列为I类致癌原。Hp感染引起的慢性胃粘膜炎症构成内源性致突变原，Hp在启动后胃癌发生的过程中出现有规律的上皮变异及基因重排、基因表达异常增加等积累与演进。同时烟酒过度、盐腌炸烤及不良饮食习惯均会增加胃癌的危险性。3 慢性胃炎脾胃湿热证的实质探讨证是中医学术特点在临床的主要体现，是疾病某一阶段的病理变化，它用一组相关的症候来表现。探索中医证的现代医学基础，可更全面准确地认识中医证及其本质，揭示它的微观变化，更有效地指导临床诊断，是提高中西医结合辨

27、证论治疗效的重要途径之一。现代分子病理学对疾病相关易感性基因的多基因调控紊乱和动态演变过程的研究与中医学以证候转归概括发病过程的方法有显著的相似之处。基因表达的改变是证的内涵。6 杨春波等对脾胃湿热证进行的大量临床研究显示7-9：脾胃湿热证与炎症性疾病关系密切，尤其与活动性炎症相关性明显，是Hp赖以生存的体内环境，且Hp产毒菌占优势，显示着胃肠粘膜慢性炎症病变潜在癌变的信号：机体对病因应答呈亢进性、失调性的组织和功能的综合病理反应。有关胃粘膜基因蛋白质表达与慢性胃炎脾胃湿热证及Hp感染、G、D细胞的相关研究少见。本课题从Hp感染、NF-B、TGF-表达及G、D细胞的数量和比值变化的角度出发初步

28、探讨慢性胃炎脾胃湿热证、脾胃气虚证及正常对照组之间的异同，根据证候是内外因相互作用导致的病机变化过程，分析慢性胃炎主要证型的基因表达调控和神经内分泌功能的变化，以求进一步阐明脾胃湿热证的证候实质，并为建立脾胃湿热证的微观辨证体系及临床疗效判定寻求理论依据。资 料 和 方 法MATERIALS AND METHODS1诊断标准1.1 中医诊断标准1.1.1 证的诊断参照中药新药临床研究指导原则第二辑10结合福建省脾胃学会制订的标准11。1.1.2 黄腻苔的诊断参照中医诊断学第六版教材。1.1.2.1 脾胃湿热证： 主症：(1)舌苔黄腻； (2)胃脘胀或痛； (3)食欲不振； (4)小便黄（淡黄、

29、黄、黄浊）； (5)大便溏；次症：(1)口苦粘； (2)口渴喜温饮； (3)身热不扬或恶寒发热； (4)舌淡红或红； (5)脉滑，或弦、细、缓。兼症：(1)溢肌肤：水肿、身重、湿疹、脓疱疮； (2)着筋骨：肢麻、筋急、关节重着或重痛； (3)扰清窍：头重如裹、耳鸣目瞀、咽痛喉肿、口舌溃疡； (4)蒙心神：但欲寐、神志时清时寐； (5)熏肺脏：胸闷、咳嗽、多痰； (6)蒸肝胆：右肋胀痛、黄疸； (7)注下焦：小腹胀或痛、大便粘滞或夹脓血、肛门灼热、 小便欠清、带下黄白。诊断脾胃湿热证：主症为必备，再加上两个以上主症（包括两个主症）或一个主症、一个次症及兼症即可。1.1.2.2 脾胃气虚证：脾虚主

30、症：(1)食欲减退；(2)大便溏泄；(3)食后腹胀；气虚主症：(1)消瘦；(2)体倦乏力；(3)头晕；(4)神疲懒言；(5)舌淡胖有齿印，苔薄白；(6)脉虚无力。次症：(1)口淡(2)呕吐(3)腹痛绵绵，喜温喜按(4)肠鸣(5)虚胖(6)面色萎黄(7)唇淡(8)气短(9)排便无力(10)白带清稀(11)浮肿(12)咳嗽痰多清稀(13)失眠(14)小便清长。判断： 1、气虚主症2个+脾虚主症2个2、气虚主症1个+舌象+脾虚主症2个3、气虚主症1个+舌象+脾虚主症1个+次症2个以上三项中具备一项即可诊断为脾胃气虚证。1.2 西医诊断标准 慢性胃炎诊断标准参照2000年全国慢性胃炎研讨会共识意见。1

31、21.2.1 内镜(1)内镜下为慢性浅表性胃炎和萎缩性胃炎，如同时存在平坦糜烂、隆起糜烂或胆汁返流，则诊断为浅表性或萎缩性胃炎伴糜烂或伴胆汁返流。(2)病变的分布及范围：胃窦、胃体、全胃。(3)内镜下慢性胃炎的诊断依据：浅表性胃炎：红斑（点、片状、条状），粘膜粗糙不平，出血点/斑。萎缩性胃炎：粘膜呈颗粒状，粘膜血管显露，色泽灰暗，皱襞细小。1.2.2 Hp感染的诊断标准 Hp感染的诊断标准参照2000年幽门螺杆菌若干问题的共识意见13。(1) Hp形态学（组织学染色）(2) 快速尿素酶实验以上二项均阳性者诊断为Hp感染。1.2.3 病理组织学诊断(1)活检取材：根据悉尼系统要求用于研究时取6块

32、标本。胃窦4块取自距幽门23cm的大弯，胃体2块取自距贲门8 cm的小弯（约距胃角近侧4cm）。其中胃窦大弯侧及体小弯侧各1块用于福建省第二人民医院病理科诊断，胃窦大弯侧及体小弯侧各1块用于快速尿素酶试验，胃窦大弯侧2块用于Hp染色和免疫组化检测。(2)不同部位的标本分开装瓶。(3)向病理科提供取材部位、内镜所见和简要病史。2研究对象：2.1 病例来源：所有病例均来源于2002年10月至2003年12月间，福建省第二人民医院脾胃病专科门诊及住院患者。2.1.1病例纳入标准：符合慢性胃炎病理诊断标准及中医辨证分型标准者，可纳入。中医辨证为脾胃湿热证或脾胃气虚证者为选择对象。2.1.2 病例排除标

33、准：(1)18岁以下或65岁以上患者，妊娠或哺乳期妇女。(2)合并心血管、脑血管、肝肾和造血系统严重原发性疾病、精神病患者。(3)中医辨证证型复杂，无主次之分者。(4)检查前2周服用过抑酸药物、糖皮质激素、非甾体类抗炎药和抗生素者。 根据以上原则，选择慢性胃炎患者58例，其中中医辨证为脾胃湿热证组33例，男14例，女19例，平均年龄40.97±8.65岁，其中浅表性胃炎24例，轻度萎缩性胃炎9例，Hp感染率72.73%；脾胃气虚证组25例，男12例，女13例，平均年龄42.36±11.64岁，其中浅表性胃炎17例，轻度萎缩性胃炎8例，Hp感染率24%。 2.1.3正常对照组

34、来源：正常对照组11例，源自福建省第二人民医院健康体检中心，无慢性上腹部闷痛等不适感史，必要的常规检查正常的体检者，行胃镜、胸透、心电图、肝功能等检查，未发现明显的器质性病变。其中男5例，女6例，平均年龄37.45±13.20岁，均为志愿者。表1 各组性别构成情况组 别例 数性男别女脾胃湿热组脾胃气虚组正常对照组合 计3325116914125311913638注：经统计学X2 检验，P>0.1,三组性别之间具有可比性表2 各组年龄构成情况组别例数年龄脾胃湿热组脾胃气虚组正常对照组332511 40.97± 8.6542.36±11.6437.45±

35、;13.20注：经统计学t 检验，P>0.1,三组年龄之间具有可比性上述各组间性别、年龄，分别经齐同性检验均具可比性。3. 常规病理、Hp染色及免疫细胞化学染色3.1常规病理：患者和正常对照组均行胃镜检查，取胃窦大弯侧和小弯侧组织，并行Hp快速尿素酶检测，经Lillies固定液固定，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4m连续切片，福建省第二人民医院病理科进行病理学诊断（分浅表性、萎缩性胃炎）。3.2 Hp染色方法：切片常规脱蜡入水，按照试剂的说明书进行染色；沥干切片上水份，将Hp染色试剂（福州后羿生物公司）滴于切片组织上，掩盖组织。常温下染5分钟；流水速洗，约2秒钟；干燥切片，中性树胶封片

36、。3.3 NF-B 、TGF-免疫细胞化学方法：（室温24）切片常规脱蜡入水，按照试剂的说明书进行染色；入0.2M HCl 20min（阻断内源性碱性磷酸酶），流水洗5min；入PH 6.0柠檬酸盐缓冲液进行高温高压抗原修复，流水洗5min；入PH 7.4的PBS（含0.1%Triton X-100）20min，PBS洗5min；滴加10%正常羊血清室温30min（减少背景非特异性染色）；去除多余血清后，分别滴加鼠抗人NF-B p65单克隆抗体（工作浓度140，Santa Cruz公司），鼠抗人TGF-单克隆抗体（工作浓度125，福州迈新生物公司），将切片置潮湿容器内，4冰箱过夜；次日取出，室

37、温放置30min，PBS洗5min×2；滴加生物素标记羊抗鼠IgG抗体，室温60min，PBS洗 5min×2；滴加碱性磷酸酶标记的链亲和素（福州迈新生物公司），室温30min，PBS 洗5min×2；pH 9.0的TBS 10 min；用BCIP/NBT（福州迈新生物公司）显色，在暗处反应（NF-B 7 min ；TGF-10min）；入5mM EDTA终止反应3 min，流水洗5min；甘油明胶封片。阴性对照片用PBS代替第一抗体，其他步骤与实验片相同。3.4 G、D细胞免疫细胞化学染色方法：（室温24）切片常规脱蜡入水，按照试剂的说明书进行染色；入0.2M

38、HCl 20min（阻断内源性碱性磷酸酶），流水洗5min；入pH7.4的PBS(含0.1%Triton X-100)20min，PBS 5min；滴加10%正常羊血清，室温20min (减少背景非特异性染色)；除去多余血清后，分别滴加即用型兔抗人生长抑素抗体(福州迈新公司)，兔抗人胃泌素抗体(福州迈新公司,1:5)，将切片置潮湿容器内，4冰箱过夜；次日取出，室温平衡30min，PBS洗5min×2；加即用型生物素标记的羊抗兔IgG抗体(福州迈新公司)，室温45 min，PBS 5min×2；加碱性磷酸酶标记的链亲合素(福州迈新公司)，室温30min，PBS 洗5min&#

39、215;2；pH 9.0的TBS 10 min；BCIP/NBT (福州迈新公司)显色，暗处反应5-10min；5mM EDTA终止反应，流水洗5min；甘油明胶封片。阴性对照片用PBS代替第一抗体，其它步骤与实验片相同。3.5 为了研究胃窦粘膜内G、D细胞的NF-B是否呈阳性反应，分别双染NF-B与G、D细胞： 切片常规脱蜡入水，按照试剂的说明书进行染色； 入3%H2O2 20min(阻断内源性过氧化物酶)，流水洗5min；入0.2M HCl 20min（阻断内源性碱性磷酸酶），流水洗5min； 入PH 6.0柠檬酸盐缓冲液进行高温高压抗原修复，流水洗5min； 入PH 7.4的PBS（含0

40、.1%Triton X-100）20min，PBS洗5min； 滴加10%正常羊血清室温30min（减少背景非特异性染色）； 去除多余血清后，滴加鼠抗人NF-B p65单克隆抗体（工作浓度140，Santa Cruz公司），将切片置潮湿容器内，4冰箱过夜； 次日取出，室温放置30min，PBS洗5min×2； 滴加生物素标记羊抗鼠IgG抗体，室温60min，PBS洗 5min×2； 滴加HRP标记的链亲和素（福州迈新生物公司）室温30min，PBS 洗5min×2； 用DAB底物混合液(10ml pH7.4 PBS, 3mg DAB, 40ul 3%H2O2)反应

41、5-10min，流水洗10min，PBS 5min×2； 滴加10%正常羊血清室温30min； 除去多余血清后，分别滴加即用型兔抗人生长抑素抗体(福州迈新公司)，兔抗人胃泌素抗体(福州迈新公司,1:5)，将切片置潮湿容器内，4冰箱过夜； 次日取出，室温平衡30min，PBS洗5min×2； 加即用型生物素标记的羊抗兔IgG抗体(福州迈新公司)室温45 min，PBS 5min×2； 加碱性磷酸酶标记的链亲合素(福州迈新公司)，室温30min，PBS 洗5min×2； pH 9.0的TBS 10 min； BCIP/NBT (福州迈新公司)显色，暗处反应5

42、-10min； 5mM EDTA终止反应，流水洗5min； 甘油明胶封片。4.结果的判断：4.1 Hp阳性结果判断4.1.1 Hp快速尿素酶检测：10分钟内试剂颜色呈紫红色判断为阳性结果。4.1.2 Hp染色结果判断：观察胃粘膜的黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面的Hp。Hp镜下呈螺旋或弧形弯曲，细点棒状，紫蓝色，丛集或散在分布于胃上皮细胞表面、胃小凹内和部分腺腔内。4.2 NF-B 、TGF-免疫细胞化学染色结果判断：细胞浆或核出现明显蓝色颗粒者为阳性反应，阳性细胞数占视野10以上有意义。细胞不着色或细胞与背景一致着色为阴性。根据染色强度和广度半定量计分：即A(每张切片染色强度)：0、

43、1、2、3分分别为无色、浅蓝、蓝色、蓝黑色； B(染色广度)：1、2、3、4分分别为阳性细胞数5、525、2650、50； A×B>=2分为组化反应阳性，23分为(+)，45分为(+)，>=6分为(+)。4.3 G、D细胞计数方法：在高倍镜下（×40），对每张切片，连续计数10个网格内的阳性细胞，每个网格面积为0.1662mm2。 先求出每个标本单位面积内阳性细胞平均值和标准差，再分别求出正常对照组、脾胃湿热组、脾胃气虚组G细胞、D细胞，G/D细胞比值的平均值和标准差。4.4 双染G、D细胞与NF-B染色结果：细胞（蓝黑色）内出现明显棕黄色颗粒（NF-B）者为阳

44、性反应。细胞内不着色为阴性。5主要仪器设备电子胃镜 OLYMPUS XQ230 日本产生物显微镜 OLYMPUS BH 日本产超净工作台 XIOP 型 中国产轮转切片机 LEITZ 1512 德国产6统计方法：均数用±S 表示，计量资料用t检验，计数资料用率的差异显著性检验和秩和检验。Spearman等级相关分析检测指标的相关性。用SPSS统计软件进行数据处理。 结 果RESULTS 1. NF-B 和TGF-在胃窦粘膜内的分布和定位：NF-B在胃窦粘膜内见于多种类型的细胞，阳性反应位于上皮细胞和腺上皮细胞的基部，正常组NF-B反应呈弱阳性，间质阴性（图1），在脾胃湿热证胃炎切片内的

45、NF-B在上皮细胞，腺上皮细胞内表达增强，并见于部分腺上皮细胞细胞核内（图2），间质内的炎症细胞和G细胞内的NF-B呈强阳性反应（图2、图15）。在脾胃气虚证胃炎切片内NF-B的阳性反应分布与脾胃湿热证胃炎的NF-B相似，但表达弱于脾胃湿热组病人（图3）。TGF-在胃粘膜内的分布和细胞内的定位与NF-B相似，也位于上皮细胞、腺上皮细胞内。在正常胃窦粘膜内TGF-反应呈弱阳性，少数见于细胞核上区呈颗粒状，间质阴性（图4），脾胃湿热证胃炎切片内的TGF-表达增强，细胞核上区颗粒状分布增多（图5），但腺腔内呈阴性反应。脾胃气虚组胃炎切片内TGF-表达较脾胃湿热组减弱（图6）。此外在胃炎组间质细胞也呈

46、不同程度的阳性反应，但未见G细胞内有TGF-免疫活性的反应。2. NF-B 和TGF-在正常人、脾胃湿热证胃炎与脾胃气虚证胃炎患者胃窦粘膜内表达的比较见表3、4。表3 NF-B在脾胃湿热证胃炎与脾胃气虚证胃炎患者胃窦粘膜内表达的比较Tab.3 The expression of NF-B in the antral mucosa of damp-heat gastritis and qi-deficiency gastritis 上 皮 腺 上 皮 间 质 epithelium glandular epithelium stroma 组 别 例数 + + + + + + + + + group

47、 cases脾胃湿热组 SSDH group 33 22* 8 3 6* 10 17* 5* 17 11* % 66.67 24.24 9.09 18.18 30.30 51.51 15.15 51.51 33.33脾胃气虚组 SSQD group 25 24 1 0 13 9 3 16 7 2 % 96.0 4.0 0 52.0 36.0 12.0 64.0 28.0 8.0正常对照组 control group 11 11 0 0 7 4 0 11 0 0 % 100 0 0 63.64 36.36 0 100 0 0 注：与脾胃气虚组比较：*P<0.05, * P<0.01;

48、 与正常对照组比较：P<0.05, P<0.01 从表3可看出脾胃湿热证患者NF-B表达阳性率高于脾胃气虚组和对照组而且有显著性差异（P<0.05 ,P<0.01）。两胃炎组间质内NF-B表达均高于正常组（P<0.05）。表4 TGF-在脾胃湿热证胃炎与脾胃气虚证胃炎患者胃窦粘膜内表达的比较Tab.4 The expression of TGF-in the antral mucosa of damp-heat gastritis and qi-deficiency gastritis 上 皮 腺 上 皮 间 质 epithelium glandular epit

49、helium stroma 组 别 例数 + + + + + + + + + group cases脾胃湿热组 SSDH group 33 23* 6 4 8* 9 16* 10* 13 10 % 69.70 18.18 12.12 24.24 27.27 48.48 30.30 39.39 30.30脾胃气虚组 SSQD group 25 23 1 1 19 4 2 14 6 5 % 92.0 4.0 4.0 76.0 16.0 8.0 56.0 24.0 20.0 正常对照组 control group 11 11 0 0 7 3 1 11 0 0 % 100 0 0 63.64 27.27 9.1 100 0 0 注：与脾胃气虚组比较：*P<0.05，*P<0.01; 与正常对照组比较：P<0.05，P<0.01从表4可看出脾胃湿热证胃炎患者TGF-表达阳性率高于脾胃气虚组和对照组（P<0.05 ,P<0.01），两胃炎组间质TGF-表达均较对照组增强（P<0.01