不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较_陶章

1、基础医学 中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第7期 20090212出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 12, 2009 Vol.13, No.7不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较*陶 章，李惠萍Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses Tao Zhang, Li Hui-pingRespiratoryDepartment,Shanghai P

2、ulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaTao Zhang, MasterResident physician,RespiratoryDepartment,Shanghai PulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaCorrespondence to:Li Hui-ping, Chiefphysician, Professor,Doctoral supervisor,RespiratoryDepartment,Affiliated Shanghai

3、Pulmonary Hospital,Tongji University,Shanghai 200433,ChinaLihuiping1958Supported by: TheNational NaturalScience Foundationof China,No.30671996*;InternationalCooperation Projectof ShanghaiMunicipal Scienceand TechnologyCommission, No.044107050*;Scientific ResearchFund Project ofShanghai MunicipalScie

4、nce andTechnologyCommission, No.064107050*; Projectof ShanghaiExcellent DeciplineLeader in 2008, No.08XD1403400*Received: 2008-06-25Accepted: 2008-10-01Abstract Tao Z, Li HP. Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linc

5、huang Kangfu. 2009;13(7): 1214-1218(China) 摘要陶章，李惠萍. 不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较J.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(7):1214-1218 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 1214陶章，等. 不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较www.CRTER.org0 引言特发性肺间质纤维化(Idiopathic pulmo-nary fibrosis，IPF)发病机制尚不清，病死率高，目前缺乏有效药物1。建立稳定而可靠的肺间质纤维化动物模型是探索其发病机

6、制和开发有效治疗药物的重要保障。目前用于肺纤维化动物模型所采用的动物主要是啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等2-5，也有选用较大体形的犬、猫、羊、猪等；肺纤维化诱导剂主要包括博莱霉素(Bleomycin，BLM)、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射线、高浓度氧、野百合碱、呼吸道肠道病毒等，其中尤以博莱霉素使用最为广泛。目前常用的肺纤维化动物模型是用博莱霉素经气管内给药来制作。博莱霉素是从轮生链霉菌中提取的一种抗肿瘤药物，国产平阳霉素是其单体，毒性小于博莱霉素。它们的毒副作用之一是引起肺纤维化，用博莱霉素制作的肺纤维化模型，其病理组织学和生理学改变与人类肺纤维化近似，因此成为肺纤维化造模的常

7、用药物。不同的动物种属对博莱霉素的反应不同，例如，大鼠常用剂量多为5 mg/kg6-7，兔的常用剂量为8 mg/kg8，而用小鼠制作动物模型则博莱霉素剂量差距很大10 mg/kg13-149-12格证号SCXK沪2007-0005)。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准21。主要试剂及仪器 注射用盐酸博莱霉素，15 mg 规格：速眠新注射液，规格：101.5 mL 羟脯氨酸检测试剂盒细胞培养箱超净工作台 台式高速离心机倒置相差显微镜石蜡切片机(Leitz 1512) 光学显微镜及成像系统(BX51型)来源日本化药株式会社解放军军事医

8、学科学院军事 兽医研究所，长春 南京建成生物工程研究所 HERA cellAIR TECH，苏净集团 Centrifuge 5810R Olympus CK 40 德国Leitz公司 日本Olympus公司实验过程：实验造模及分组干预：同济大学附属上海市肺科医院呼吸科，上海市200433陶 章，男，1978年生，安徽省宿州市人，汉族，硕士，医师，主要从事间质性肺病的研究。 taozhang1978通讯作者：李惠萍，主任医师，教授，博士生导师，同济大学附属上海市肺科医院呼吸科，上海市200433lihuiping1958国家自然科学基金资助项目(30671996)*；上海市科委国际合作项目(04

9、41070 50)*；上海市科委科研基金资助项目(064107050)*；2008优秀学科带头人计划(08XD 1403400) *中图分类号:R322 文献标识码:B文章编号:1673-8225(2009)07-01214-05收稿日期：2008-06-25 修回日期：2008-10-01 (54200806240021/ WLS)，最大剂量为15，最小剂量为0.01 mg/kg，使16-18用最多的剂量为5 mg/kg8 mg/kg19-20。本科在既往研究中使用的博莱霉素剂量是，发现模型小鼠死亡率较高，严重影响动物实验的顺利进行。分析原因之一可能与博莱霉素剂量过大有关。为了保证动物模型的

10、稳定性和可靠性，实验尝试了几种不同剂量的博莱霉素制作小鼠肺纤维化模型，以期筛选出既能成功地制作小鼠肺纤维化模型，又不至于导致过高死亡率的一种最佳的博莱霉素造模剂量。1 材料和方法设计：随机对照动物实验。时间及地点：实验于2007-09/2008-04在上海市发育生物学重点实验室完成。材料：SPF级健康雌性C57BL/6J小鼠60只，体质量1822 g，平均20 g，8周龄，购自上海市中国科学院实验动物中心(动物合ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH在小鼠气管内注射博莱小鼠28 d 内死亡情况：霉素或生理盐水后，每日上午9点、下午5点观察小鼠的死亡情

11、况，记录小鼠的死亡时间，观察到第28天，计算死亡率和中位生存时间。小鼠肺组织病理学检查：造模后第28天，随机分3批麻醉，腹主动脉放血处死动物，分离左侧肺脏，注入体积分数为0.1的甲醛1.0 mL，固定24 h，常规脱水、石蜡包埋后，切片(6 m)， 行苏木精-伊红染色，光镜下观察肺组织炎症及纤维化情况。1215www.CRTER.org陶章，等. 不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较实验第28天肺组织羟脯氨酸含量测定：肺组织羟脯氨14，28 d 死亡率和实验28 d 时的中位生存时间，见表1。酸含量的测定按照试剂盒要求进行，具体步骤如下：称取湿质量为50100 mg 的肺组织；剪碎后放入带

12、盖试管，加1 mL水解液，加盖后混匀，沸水浴水解20 min；试管经流水冷却后加指示剂1滴，摇匀；加入pH甲液1 mL至溶液变红，混匀；逐滴加入调pH乙液，直至液体颜色变成黄绿色；加蒸馏水至10 mL，混匀；取4 mL 液体放入离心管，加适量活性炭，混匀，3 500 r/min 离心10 min，取上清1 mL加入另一个离心管(空白管和标准管分别加入蒸馏水或5 mg/L标准液各1 mL)；加试剂一0.5 mL后混匀，静置10 min；加试剂二0.5 mL后混匀，静置5 min；加试剂三0.5 mL，混匀后60 水浴15 min；冷却后3 500 r/min 离心10 min，取上清在550 n

13、m处，1 cm光径，蒸馏水调零，测吸光度(A)值；记录各管吸光度后按公式计算各肺组织羟脯氨酸含量。羟脯氨酸(mg/g)=(测定管吸光度空白管吸光度)/(标准管吸光 度空白管吸光度)标准管含量(5 mg/L)水解液总体积 (10 mL)/ 组织湿质量(mg)肺组织纤维化程度的判定：按Szapiel等22的方法评2.3 肺脏大体观察结果价肺组织病理变化严重程度，具体分级标准如下：主要观察指标：小鼠死亡数量，28 d 后小鼠肺组织羟脯氨酸含量，肺组织纤维化程度。设计、实施、评估者：实验设计及评估为第二作者，干预实施为第一作者，经过正规培训，采用盲法评估。统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软

14、件完成统计处理，计量资料以xs表示，多个样本率的比较采用2检验，对照组和博莱霉素组羟脯氨酸含量比较采用Kruskal-Wallis H检验，对照组和博莱霉素不同剂量组羟脯氨酸含量的组间两两比较采用Mann-Whitney U检验，P 0.05)，但从原始数据分析， 5 mg/kg博莱霉素组死亡率超过90%，明显高于 3.5 mg/kg博莱霉素组和2 mg/kg博莱霉素组，如此之高的死亡率使得实验将无法进行，因此该剂量不适合小鼠的造模。博莱霉素组间比较死亡率差异亦无显著性意义(P 0.05)，可能与样本太少有关，但从数字上可看出，博莱霉素剂量越高，死亡率越高。从各组肺脏大体标本观察结果、肺组织病

15、理标本纤维化程度和各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量来看，博莱霉素剂量越高，肺纤维化程度越重，以5 mg/kg 博莱霉素组最明显。综上所述，博莱霉素剂量越大，小鼠肺纤维化程度越高，28 d 死亡率也最高；而博莱霉素剂量越低，则小鼠肺纤维化程度越低，存活率越高。平衡造模效果和动物存活率，认为经气管内注射博莱霉素3.5 mg/kg 是较为理想的博莱霉素制作小鼠肺纤维化模型的剂Figure 1 The pulmonary pathological changes of the mice inthe bleomycin and control groups (Hematoxy-lin-eosin stain

16、ing, 100)图1 各组小鼠第28天肺组织的变化(苏木精-伊红染色，100)5 mg/kg 博莱霉素组因小鼠存活数量太少不做统计分析，表3可见，各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量从高到低依次为5 mg/kg 博莱霉素组(1只小鼠，肺组织羟脯氨酸含量为0.660 mg/g)、3.5 mg/kg 博莱霉素组、 量。ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH1217www.CRTER.org陶章，等. 不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较4 参考文献 1Duan BX,Huang RY,Chu YL. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yan

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