乳铁蛋白与骨质疏松症

1、乳铁蛋白与骨质疏松症天然产物研究与开发NatProdResDev,2007,19:566-568,507文章编号:1001-6880(2007)Suppl-0566-04乳铁蛋白与骨质疏松症康萍,印遇龙h中国科学院亚热带农业生态研究所,长沙4101252中国科学院研究生院,北京100049摘要:本文主要阐述T?L铁蛋白对造骨细胞,破骨细胞及半胱氨酸蛋白酶的作用,由于其对造骨细胞有促进作用及对破骨细胞和半胱氨酸蛋白酶(如K,L)的抑制作用,因此乳铁蛋白是治疗骨质疏松症的一种潜在的治疗手段.关键词:乳铁蛋白;骨质疏松症中图分类号:R285文献标识码:ALactoferrinandOsteoporo

2、sisKANGPing._.YINYu.1ongInstituteofSubtropicalAgriculture,theChineseAcademyofScience,Changsha410125,China;GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beiing100049,ChinaAbstract:Thisarticlemainlytalkabouttheeffectoflactoferrinontheosteoblasts,oteoclastsandeaspase,becauseitcansimulatetheosteoblastsan

3、dinhibittheosteoclastsandeaspase,thus,itisprobablyapotentialmedicinefortherapyosteoporosis.一Keywords:laetoferrin;osteoporosis骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种骨量减少,骨组织微结构破坏,骨强度降低,骨脆性增加而易骨折的全身性疾病.在老年人中,骨质疏松症的发病率较高,目前对其的治疗作用也仅限于恢复骨的质量,且在最好的情况下,能将由其引起的骨折发生率降到50%-1J.骨的生长受许多激素和生长因子的调控,而其形成是由成骨细胞,破骨细胞及骨吸收细胞等相互复杂作用

4、的结果.目前在骨吸收抑制方面的治疗用药有雌激素,降钙素,双膦酸盐类等,在促进骨形成方面的治疗用药有维生素D及其活性代谢物,氟化物,甲状旁腺激素,他汀类药物,锶盐及中药等,但乳铁蛋白对其的治疗作用国内还未见报道.Cornish(2004)通过体内和体外试验表明乳铁蛋白不论在骨的生长期还是成熟期都对骨的生长有促进作用,进而认为乳铁蛋白是治疗骨质疏松症的一种潜在的治疗手段.1乳铁蛋白的分子结构乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)1960年首先由Groves收稿13期:2007-0413接受13期:2007-06-20基金项目:国家自然科学基金(3C/0C581)通讯作者Te1:86-731-46

5、19706;Emall:yyulonghotmail.corn从牛乳中分离获得.因与铁结合而呈红色,故称之为红蛋白.乳铁蛋白在人类初乳中含量最高,牛乳中的含量比人乳中少得多,狗乳中则不含.此外,它还广泛存在于乳汁,唾液,泪液等外分泌液或血浆和中性粒细胞中.LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质,它不仅参与铁的转运,而且具有杀菌,抗氧化,抗癌,调节免疫等许多特殊的生理生化功能.LF是由转铁蛋白(Transferrin)演变而来的,分子量约为80kD的铁结合性糖蛋白,其多肽链上结合有两条糖链,其组成包括甘露糖,半乳糖,N一乙酰半乳糖胺,唾液酸及岩藻酸等.人和牛LF的一级结构具有高度的相似性,二者同源

6、性高达69%.LF的二级结构是由一螺旋和一折叠交替排列组成.Grossmann(1992)发现人LF的立体结构包括两个同源的叶N叶和c叶(两者各占一半),其中N叶由l一333个氨基酸残基组成,C叶由335692个氨基酸残基组成,两者在334344处由三个一螺旋连接,每个叶又包括两个结构域,每个结构域在其域间裂隙的内表面有一个铁离子(Fe)结合位点,每个Fe又与四个蛋白质配体,即两个酪氨酸,一个精氨酸和一个组氨酸,以及一个阴离子(在体内通常是碳酸盐)配位,每个LF可以结合两个Fe和两康萍等:乳铁蛋白与骨质疏松症567个co2_3.2乳铁蛋白对造骨细胞的影响Cornish等(2004)在体外试验中

7、已经表明,乳铁蛋白可刺激骨形成细胞及造骨细胞的有丝分裂,分化及存活,此外,在小鼠头颅的局部注射乳铁蛋白可增加体内新的骨细胞的形成;此外,结合经原始或细胞系培养的人类或鼠的造骨细胞样细胞,还发现在生理浓度条件下(1100ixg/mL),乳铁蛋白会产生依赖其剂量而增加的大量胸苷,并且最高的产生量超过对照组的5倍;乳铁蛋白增加了造骨细胞的分化,使造骨细胞的死亡减少了50%一70%,同样的,乳铁蛋白还促进原始的软骨细胞的分化.在鼠骨髓细胞的培养中,破骨细胞的数量依乳铁蛋白剂量的增加而减小,并在100Ixg/mL的浓度下可被乳铁蛋白完全捕获,此过程伴随着细胞核因子KB配体的受体激活因子表达量的减少.此外

8、通过给成年鼠的头颅连续注射5天的乳铁蛋白.应用荧光标记表明,4mg的乳铁蛋白就可使新骨细胞的形成增加4倍引.Cornish(2004)已经表明牛和人类的乳铁蛋白是骨组织生长中的合成因子.在体外,乳铁蛋白(其生理浓度在0.1Ixg/mL以上)刺激了骨形成细胞,软骨细胞和造骨细胞的分化,并且这样大的影响力超过了其它对骨生长的影响因素,如IGF一1和TGF-/3等J.乳铁蛋白也是一种有效的造骨细胞存活因子.在对TUNEL和DNA的序列分析中,表明乳铁蛋白减少了70%以上造骨细胞的死亡.在体内,给成年鼠局部注射乳铁蛋白可导致头颅骨骼的生长,且在仅注射5次情况下,就显着增加了骨面积.在100Ixg/mL

9、的浓度下,乳铁蛋白可显着增加骨结节形成的数量和面积.乳铁蛋白可促进骨质的沉积和骨的矿物化.且铁的饱和度似乎对成骨质的行为无明显影响.Lorget(2002)已经表明,在兔的混合骨细胞的培养中,牛乳铁蛋白能降低骨吸收的活性引.目前乳铁蛋白的受体有低密度脂蛋白受体结合蛋白LRP1和LRP2【6圳,他们是吞噬受体LRP家族的多配体成员.最近的研究表明LRP1同时兼有信号受体和吞噬受体的功能1】.Cornish等(2005)报道乳铁蛋白对造骨细胞样细胞的有丝分裂的刺激是通过LRP1介导的,并应用激光共焦点扫描显微镜,发现乳铁蛋白似乎被原始的造骨细胞所吞噬.然而.LRP1的吞噬和信号功能是相互独立的,因

10、为乳铁蛋白能在吞噬作用被抑制的情况下激活有丝分裂的信号引.3乳铁蛋白对破骨细胞的影响Cornish(2004)报道乳铁蛋白可剂量依赖性的降低破骨细胞的形成,此外,乳铁蛋白对破骨细胞有重大影响,当乳铁蛋白的浓度在鼠骨髓培养系统中大于1Ixg/mL时,就会降低破骨细胞的增殖.然而.在头颅组织的培养中,乳铁蛋白没有改变这种作用.表明乳铁蛋白并不影响成熟破骨细胞的作用引.4乳铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制作用半胱氨酸蛋白酶是广泛存在于植物,细菌,病毒,原生动物和哺乳动物组织中的一类重要蛋白酶,人体中的半胱氨酸蛋白酶主要包括组织蛋白酶B,c,K,H,L和s等,以及属于钙离子激活神经蛋白酶家族的I型和II型

11、钙离子激活神经蛋白酶.近年来发现组织蛋白酶K,L是破骨细胞中高度表达的酶,其主要在破骨细胞中选择性,特异性地表达,参与骨质的再吸收代谢(骨吸收)调节,从而与骨质疏松症等骨质减少性疾病有关J.有研究报道,在半胱氨酸蛋白酶中,主要是组织蛋白酶B,N,L和S能通过降解骨胶原参与骨的吸收过程J.Gowen等(1999)通过免疫组化发现,正常关节中骨与软骨交界处破骨细胞的胞内半胱氨酸蛋白酶K,B特别丰富,说明其明显参与钙化软骨吸收和软骨内进一步钙化引.研究表明组织蛋白酶K,L主要是通过调节骨纤维胶质降解促进骨吸收ll引.骨吸收主要由破骨细胞调节,破骨细胞分泌的组织蛋白酶K,L的前体蛋白在骨吸收腔隙中被激

12、活,参与骨质的代谢.骨质中的细胞外有机物质主要是I和II型纤维胶质,其中I型胶质约占90%,骨吸收过程的一个重要环节是纤维胶质的分解代谢,研究发现组织蛋白酶K通过作用于I和II型纤维胶质的N端三股螺旋处而降解骨纤维胶质J.Ohashi等(2003)发现乳铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶有强烈的抑制作用.尤其对半胱氨酸蛋白酶L的抑制作用最强,并且这种抑制作用是非竞争性的l2.研究表明,乳铁蛋白C末端的17个碱基序列与半胱氨酸蛋白酶抑制剂通常的活性部位有60%的一致性和90%的同源性l23J.568天然产物研究与开发V01.19因此,乳铁蛋白被认为是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员.在1OM水平下,乳铁蛋

13、白可完全抑制木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶L,在1O.M水平抑制半胱氨酸蛋白酶B和S,但蛋白酶C除外.不论有没有Fe离子,乳铁蛋白都对这些半胱氨酸蛋白酶有相同的抑制作用,因此乳铁蛋白具有铁载体与半胱氨酸蛋白酶抑制剂双重作用,从而可能通过抑制半胱氨酸蛋白酶而间接影响骨的生长.5展望综合起来,这些数据说明乳铁蛋白在体内可促进骨的合成,原因在于其促进造骨细胞的分化与抑制死亡及对破骨细胞和半胱氨酸蛋白酶(如K,L)的抑制作用.因此可以断定乳铁蛋白对骨的生长有生理作用,可作为潜在的治疗骨质疏松症的药物,但国内目前对乳铁蛋白的生产还处于空白,因此限制了其的应用.参考文献1CranneyA,GuyaG,Grif

14、fithL,eta/.111eoste0porosismeth-odologygroupandtheosteoporosisresearchadvisorygroup,metaanalysesoftherapiesforpostmenopausalosteoporosis.IX:summaryofmeta-analysesoftherapiesforpostmenopaus-alosteoporesis.EndrineReviews,2002,23:570-578.2CornishJ.Lactoferrinpromotesbonegrowth.Biometa/s,2004.17:331-333

15、.3GrossmannJG,NeuM,PantosE,eta1.X-raysolutionscat-tefingrevealsconformationalchangesuponironuptakeinlactoferrin,serumandOVO-transferrins.JularBiology,1992.225:811-819.4CornishJ,GallonKE,NaotD,eta1.Lactoferrinisapotentregulatorofbonecellactivityandincreasesboneformationinvivo.Endocrinology,2004,145:4

16、366-4374.5LorgetF,CloughJ,OliveiraM,eta1.Lactoferrinreducesinvivoosteoclastdifferentiationandresorbingactivity.Biochem-icaland日ResearchCommunications,2002,296:261-266.6WillnowTE,GoldsteinJL,OrthK,eta1.Lowdensityllpopro-teinreceptor-relatedproteinandgp330bindsimilarligands,includingplasminogenactivat

17、or-inhibitorcomplexesandlact-oferrin.aninhibitorofchylomicronremnantclearance.JBio-icolCtry,1992,267:26172-26180.7MeilingerM,HaumerM,SzakmaryKA,eta1.Removaloflactoferfinfromplasmaismediatedbybindingtolowdensityllpoproteinreceptor-relatedprotein/alpha2-macroglobullnreceptorandtransporttoendosomes.FEB

18、SLetters,1995,360:7O_74.8JIZS.MahleyRW.LactoferrinbindingtoheparansulfateproteoglycansandtheLDLreceptor-relatedprotein.Furtherevidencesupportingtheimportanceofdirectbindingofrem-nantlipoproteinstoHSPG.ArteriosclerosisandThrombosis,1994,14:2025-2031.9VashB,PhungN,ZeinS,eta1.Threecomplement-typere-pea

19、tsofthelow-densitylipoproteinreceptor-relatedproteindefineacommonbindingsiteforRAP,PAI-landlactoferrin.Blood,1998,92:3277-3285.10StricklandDK,GoniasSL,ArgravesWS.DiverserolesfortheLDLreceptorfamily.TrendsEndocrinologyMetabolism.2002.13:66_74.11He=J,GotthardtM,WillIl0wTE.Cellularsignalingbylipo?prote

20、inreceptors.CurrentOpinionin2Dgy,2000,11:161.166.12UY,CamJ,BuG.Lowdensitylipoproteinreceptorfamily:endocytosisandsignaltransduction.MolecularNeurobiology,2001,23:5367.13CornishJ,GreyAB,NaotD,eta1.Lactoferrinandbone:anoverviewofrecentprogress.AustralianJournalofDairyTechn,2oo5,60:53-57.14BossardMJ,To

21、maszekTA,ThompsonSK,eto2.ProteolytieactivityofhumanosteoclastcathepsinK.Expression,pufifi-cation,activation,andsubstrateidentification.JBiologicalChemistry,1996,271:12517-12524.15KakegavaH,NikavaT,TagamiK,eta/.Participationofca?thepsinLonboneresorption.FEBSLetters,1993,321:247-250.16RoseAM.SandraFW.

22、SusceptibilityoftheCartilageColla-gensTypes.IXandtoDegradationbytheCysteinePro-teinases,CathepsinBandL.FEBSLetters,1990,269:189-193.17CronelisJF,VanN,VincentE.SelectiveInhibitionofCyste-ineProteinases(suchasCathepsinBandL)byZ-Phe-AlaCH2F.Biochemica/andBiophysicalResearchCommunica-tions,1991,178:178-

23、184.18GowenM,LaznerF,DoddsR,eta1.CathepsinKknockoutmicedeveloposteopetrosisduetoadeficitinmatrixdegrada-tionbutnotdeminerallzation.JBoneMineralRes,1999,14:1654.1663.19YamazaT,GotoT,KamiyaT,eta1.StudyofimmunoelectronmicroscopiclocalizationofcathepsinKinosteoclastsandotherboneceUsinthemousefemur.Bone,

24、1998,23:499-509.(下转第507页)廖森泰等:桑枝总黄酮的提取工艺研究507g与实测值非常接近,同时也进一步验证了数学回归模型合适性.为实际操作简便起见,将优化的工艺条件调整为:温度80,时间3.5h,乙醇浓度60%,料液比1:40,经验证桑枝总黄酮含量为6.23mg/g,与理论值也非常接近.讨陀二次回归正交旋转组合设计是将回归正交设计与旋转设计组合起来的一种方法,它在理论上同时具有正交.陛和旋转性.该试验布点分散均匀,试验次数少,消除了回归系数的相关性,可直接找出预测值相对较优的区域,克服了多因子,多水平试验的弱点,而且一次试验可获得较多的信息,降低了试验成本,缩短了研究周期.

25、它以回归方程作为函数估算的工具,将多因子试验中,因素与试验结果的关系用多项式拟合,把因子与试验结果的关系函数化,因此,可对函数的面进行分析,研究因子与试验结果之间,因子与因子之间的相互关系,并进行优化.它克服了正交试验只能给出最佳因素水平组合,而无法找出整个区域上因素的最佳组合和试验结果的最优值的缺陷.目前对植物中黄酮的提取条件研究多采用正交设计法,但正交设计只能处理离散的水平值,在实际应用中不免会有诸多局限性.本研究将二次回归正交旋转组合设计应用于桑枝总黄酮的提取中,优化出其最佳提取溶剂浓度,提取时间和料液比等条件,为桑枝的药用开发打下基础.参考文献1ChinaPharmacopoeiaCo

26、mmittee(中华人民共和国药典委员会).ChinesePharmacopoeia(中华人民共和国药典).Beijing:ChemicalIndustryPress,2005.210.2NewMedicalCollegeofJiangshu(江苏新医学院).ADictionaryofChineseTraditionalMedicine(中药大辞典).Shanghai:ShanghaiScientific&TechnicalPublishers,1900.1996.3LiuMY(刘明月),MuY(牟英),KsF(李善福),et口z.Studyonantiirdlammatoryactivityofthe95%ethanolextractsofRamulmori.JShanxiCollTradChinMed(山西中医学院),2003,4(2):1314.4Jiazs(贾之慎),TangMC(唐孟成),ZhuXR(朱祥瑞).StudyOileffectofscavengingsuperoxidefreeradicalonmulberrrflavonoids.JZhejngagricUn/v(浙江农业大学学报),1996,22:519-523.5LiuSX(刘善瓶),JiaYY(贾元印).S