蛋白质结构与功能3ppt课件

1、(四四)第四节第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 一一 、蛋白质的理化性质、蛋白质的理化性质二、二、 蛋白质分离和纯化蛋白质分离和纯化三、三、 多肽链中氨基酸顺序分析多肽链中氨基酸顺序分析 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定（一两性解离和等电点（一两性解离和等电点及其分离纯化及其分离纯化 Pr Pr是两性电解质。在溶液中的带电状况是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的主要取决于溶液的pHpH值。值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2OH-H+OH-H+pH=pIpHpIpIpI定义：定义： 在某一在某一pHpH值溶液中，值溶液中，PrPr酸性基团和

2、碱性基团酸性基团和碱性基团的解离程度相当的解离程度相当PrPr分子所带正负电荷相等，净电分子所带正负电荷相等，净电荷为零此时溶液的荷为零此时溶液的pHpH值称为值称为PrPr的的pIpI。PrPr分子颗粒大小分子颗粒大小1-100nm1-100nm之间之间, ,属胶体颗粒范围，属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。在溶液中能形成稳定的胶体。缘由：缘由：（二蛋白质的胶体性质（二蛋白质的胶体性质表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力1. 1. 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)(denaturation)定义：在某些理化因素的作用下，定义：在某些理化

3、因素的作用下，PrPr严格的空间结构被破坏严格的空间结构被破坏 （不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生 物学性质改变的现象。物学性质改变的现象。变性因素变性因素物理因素物理因素高温、高压高温、高压紫外线、紫外线、X射线、射线、电离辐射和超声波等电离辐射和超声波等化学因素化学因素强酸、强碱强酸、强碱有机溶剂、重金属盐有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响分子组成、破坏了空间结构，一级结构不受影响分子组成、MWMW不变）。不变）。变性蛋白质的特点变性蛋白质的特点旋光性、光吸

4、收改变等；旋光性、光吸收改变等；生物学活性丧失生物学活性丧失理化性质改变理化性质改变易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解溶解度溶解度，沉降率，沉降率，粘度粘度，扩散速度扩散速度，酶水解。酶水解。变性变性可逆变性：可逆变性：Pr变性后如将变性剂除去，该变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学分子的天然构象和生物学 活性还能恢复。活性还能恢复。不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性 质难以恢复。质难以恢复。举例：医疗；生物制品保存；生活等。举例：医疗；生物制品保存；生活等。+-+-带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电

5、点的蛋白质酸酸酸酸碱碱碱碱脱水脱水脱水脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）碱碱酸酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（五）、蛋白质的呈色反应分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤分子筛）凝胶过滤分子筛）亲和层析亲和层析。电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法纯度、纯度、Mw和和pI测定测定层析法：凝胶过滤层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法高效液相色谱法电泳法：电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电、梯度凝胶电泳、等电

6、聚焦电泳等泳等免疫化学法：专一的沉淀线免疫化学法：专一的沉淀线SDS PAGE电泳法：测定亚基数电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一超速离心：成分均一其它：如其它：如, 结晶法结晶法叫分段盐析法叫分段盐析法 等电聚胶电泳等电聚胶电泳 (isoelectric focusing gel IEF) SDS-PAGE separates proteins by MW带正电荷多带正电荷多蛋白紧密结合蛋白紧密结合带负电荷多带负电荷多蛋白流过层析蛋白流过层析柱柱阳离子交换树脂工作示意图阳离子交换树脂工作示意图Cation-exchangecolumnColumnChromatography琼脂琼脂 糖糖凝

7、胶凝胶连接臂连接臂Affinitychromatography定义：利用半透膜把大小分子分开定义：利用半透膜把大小分子分开 的方法。的方法。运用：运用：1.1.腹膜透析和人工肾腹膜透析和人工肾 ； 2. 2.反透析反透析 ； 3. 3. 超滤利用压力或离心力强行使水和小超滤利用压力或离心力强行使水和小分子杂分子杂 质通过超滤膜除去，质通过超滤膜除去，PrPr留在膜上而称之。留在膜上而称之。 透析工作图透析工作图半透膜原理半透膜原理 超速离心超速离心 步骤：步骤： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加样加样 C.离心离心 D.收集样品收集样品5. 5.测定水解液中的氨量，计算酰测定水解液中的氨

8、量，计算酰胺的含量。胺的含量。倒推法倒推法顺序测定法顺序测定法倒推法：倒推法：组织组织Pr、DNAmRNAcDNA测定并识读测定并识读cDNA序列序列分析分析AA组成，推知组成，推知Pr一级结构一级结构逆转录酶逆转录酶蛋白质纯）蛋白质纯） 测定分子量，估计AA残基数除120）氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪测定测定AA数量、种类和比例数量、种类和比例肽链拆开肽链拆开次级键：用次级键：用8mol/L脲脲 或或6mol/L 盐酸胍盐酸胍二硫键：过甲酸；巯基乙醇；二硫键：过甲酸；巯基乙醇；1，4二硫代苏糖醇二硫代苏糖醇肽链末端分析肽链末端分析N端：二硝基氟苯；丹磺酰氯法端：二硝基氟苯；丹磺酰氯法C端

9、：肼解法；羧肽酶法端：肼解法；羧肽酶法肽链选择性裂解肽链选择性裂解化学法：溴化氰裂解；羟胺法化学法：溴化氰裂解；羟胺法酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋 白酶、木瓜蛋白酶等白酶、木瓜蛋白酶等肽段分离肽段分离凝胶过滤凝胶过滤离子交换层析离子交换层析氨基酸顺序分析：氨基酸顺序分析：Edman法异硫氰酸苯降解法）；酶法异硫氰酸苯降解法）；酶解法解法多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸序序列列分分析析的的主主要要步步骤骤纯度、纯度、Mw和和pI测定测定层析法：凝胶过滤层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法高效液相色谱法电泳法：电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚、梯度凝胶电泳、等电聚

10、焦电泳等焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线免疫化学法：专一的沉淀线SDS PAGE电泳法：测定亚基数电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一超速离心：成分均一其它：如其它：如, 结晶法结晶法一、名词解释一、名词解释氨基酸残基氨基酸残基 亚基亚基 变构效应变构效应 协同效应协同效应 PrPr的两性电离的两性电离 PrPr的的pI pI 盐析盐析 蛋白质变性蛋白质变性 超二级结构超二级结构 结构域结构域分子伴侣分子伴侣复习思考题复习思考题1. 1.为什么说：为什么说：“蛋白质是生命的物质基础蛋白质是生命的物质基础”？2. 2.简述蛋白质简述蛋白质螺旋和螺旋和折叠的结构特点。折叠的结构特点。3. 3.什么

11、是什么是PrPr的一、二、三和四级结构，分别指出的一、二、三和四级结构，分别指出 维持它们结构的化学键。维持它们结构的化学键。4. 4.举例说明举例说明PrPr结构与功能的关系。结构与功能的关系。5. 5.简述简述PrPr变性、沉淀和凝固的定义及彼此之间的关系。变性、沉淀和凝固的定义及彼此之间的关系。6.Pr6.Pr定量测定的方法主要有哪些？定量测定的方法主要有哪些？二、问答题二、问答题1 1 天然蛋白质中不存在的氨基酸是天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A A蛋氨酸蛋氨酸B B胱氨酸胱氨酸C C羟脯氨酸羟脯氨酸D D同型半胱氨酸同型半胱氨酸E E精氨酸精氨酸2 2下列哪种氨基酸在肽链中形成拐角下

12、列哪种氨基酸在肽链中形成拐角A A缬氨酸缬氨酸B B酪氨酸酪氨酸C C脯氨酸脯氨酸D D苏氨酸苏氨酸E E色氨酸色氨酸三、选择题三、选择题4. 4. 有关血红蛋白有关血红蛋白(Hb)(Hb)和肌红蛋白和肌红蛋白(Mb)(Mb)的叙述不正确的是的叙述不正确的是 A.A.都可以和氧结合都可以和氧结合 B.HbB.Hb和和MbMb都含铁都含铁 C.C.都是含辅基的结合蛋白都是含辅基的结合蛋白 D.D.都具有四级结构形式都具有四级结构形式 E.E.都属于色蛋白类都属于色蛋白类5 5 有一血清清蛋白有一血清清蛋白(pI(pI6 685)85)的混合物，在哪种条件下电泳分的混合物，在哪种条件下电泳分 离效

13、果最好离效果最好? ? A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 E.pH3.5 E.pH3.5 3 3 下列有关蛋白质下列有关蛋白质片层结构的叙述正确的是片层结构的叙述正确的是 A. A.主链骨架呈锯齿状主链骨架呈锯齿状 B. B.两个相邻的肽平面呈折纸状两个相邻的肽平面呈折纸状 C. C.片层结构是一种较伸展的肽链结构片层结构是一种较伸展的肽链结构 D. D.若干矩齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系若干矩齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系 E. E.以上都正确以上都正确7.7.蛋白质分子引起蛋白质分子引起280nm280nm光吸收的最主要成分是光吸收的最主要成分是 A.A.肽键肽键 B.B.半胱氨酸的半胱氨酸的-SH-SH基基 C.C.苯丙氨酸的苯环苯丙氨酸的苯环 D.D.色氨酸的吲哚环色氨酸的吲哚环 E.E.组氨酸的咪唑环组氨酸的咪唑环6. 经凯氏定氮法测定，一血清标本的含氮量为经凯氏定氮法测定，一血清标本的含氮量为10g/L ，那么，蛋白，那么，蛋白质的浓度是多少？质的浓度是多少？ A. 52.5g/L B. 57.5g/L C. 62.5g/L D. 67.5g/