终末期肾病患者血清蛋白质组二维电泳图像与正常血清蛋白图谱比较

1、终末期肾病患者血清蛋白质组二维电泳图像与正常血清蛋白图谱比较研究王剑青1,戴勇2,邓安国1,刘建军3(11华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科,湖北武汉430022;21广东省深圳市人民医院31广东省深圳市疾病预防控制中心【摘要】目的建立和优化终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳及相关技术,并与正常血清蛋白图谱比较。方法以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直S DS2聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,对终末期肾病患者血清蛋白质样品制备、上样量、I PG胶条、等电聚焦等进行条件优化。质谱鉴定有差异表达的其中4个蛋白点。结果成功获得终末期肾病患者血清蛋白质组电泳图谱,与正常者相比存在表达有明显差异

2、的蛋白点。结论成功建立了终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳技术平台。关键词肾功能衰竭;蛋白质组;电泳,凝胶,双向Est ablish m en t of two2d i m en si ona l gel electrophoresis techn i ca l pl a tfor m for the blood seru m proteo m e research i n pa ti en ts w ith end st age rena l d isea seWAN G J ian2qing,DA I Yong,D eng A n2guo,L I U J ian2jun.Depart

3、 m ent of Nephr ol ogy,Uni on Hos p ital,TongjiM edical College,Huazhong University of Science and Technol ogy,W uhan430022,China【Abstract】O bjecti veTo establish and op ti m ize the t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis technical p latf or m f or the bl ood seru m p r o2 teome research in patie

4、nts with end stage renal disease(ESRD.M ethodsI m mobiline pH gradients is oelectric focusing was used as the first di m ensi onal gel electr ophoresis and the vertical S DS2P AGE was used as the second di m ensi onal gel electr ophoresis(22DE.The4dif2 ferentially exp ressed p r otein s pots were id

5、entified by mass s pectr ometry.ResultsSatisfact ory22DE map s of ESRD patients seru m p r otein were obtained and there were s ome differentially p r otein s pots bet w een the22DE map s of ES RD patients and nor mal contr ols.Conclusi on sThe22DE technol ogy for the seru m p r oteome of ESRD patie

6、nts is set up.【Key words】Kidney failure;Pr oteome;Electr ophoresis,gel,t ow di m ensi onal自从发现22MG 参与透析相关淀粉样变后,提示蛋白质可成为一类特殊的尿毒症毒素1。现已分离和鉴定出的蛋白质毒素有数十种,但终末期肾病(ESRD患者症状及并发症复杂,仅用数十种蛋白和其它一些中分子及小分子毒素并不能完全解释。若能将ESRD 患者和正常人的血清蛋白质谱比较,将为今后对那些异常表达的蛋白进行分离、鉴定和体内外实验,最终判定是否为尿毒症蛋白质毒素提供一个早期实验基础。但血液蛋白质成分复杂,含有多种盐、脂质等影

7、响蛋白质分离的物质2,因此建立一个优化的血液蛋白质组研究技术体系非常重要。为获得准确性和重复性高的ESRD患者差异性表达的血清蛋白质点,本研究对ESRD患者和正常人的血清蛋白质进行双向电泳(2DE条件摸索,优化实验方案,最终获得了满意的蛋白质电泳图谱,并用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALD I2T OF2T OF2MS成功鉴定了任意选取的4个差异表达的蛋白点。1材料与方法11一般资料ESRD组根据叶任高主编的第五版内科学尿毒症诊断标准3,选择4名病因为慢性肾小球肾炎的男性ESRD患者,年龄4160(5113±811岁,为2004年10月11月深圳市人民医院肾内科住院病人,

8、属保守治疗。患者病情稳定,采血前一月内无细菌感染征象、无心衰和糖尿病等病史。血压控制在92140/7690mmHg(1mmHg=01133kPa,平均动脉压为(9516±814mmHg。肌酐630789mol/L,平均(698±90mol/L,尿量8001000m l/ d。对照组选4名该院门诊男性健康体检者。年6Bozcuk H,U slu G,Pestereli E,et al.Predict ors of distant metastasis at p resentati on in breast cancer:a study als o evaluating ass

9、 ociati ons a mong common bi ol ogical indicat ors.B reast Cancer Res Treat,2001,68(3: 239.7R i ou G,Mathieu MC,Barr ois M,et al.c-erbB-2(HER-2/neu gene a mp lificati on is a better indicat or of poor p r ognosis than p r otein over-exp ressi on in operable breast-cancer patients.I nt J Cancer,2001,

10、 95(4:266-270.8刘彤华主编.诊断病理学.北京:人民卫生出版社,1994,577-587.收稿日期:2004-03-0173中国医师杂志2006年1月第8卷第1期龄4060(5218±716岁。血压90132/6086mm 2Hg,平均动脉压为(8514±611mmHg 。肌酐5491(72±20mol/L,尿量15002000m l/d 。12材料主要试剂及仪器13c m I PG 胶条(pH 4-7L 、24c m I PG 胶条(pH 3-10L 、尿素、硫脲、CHAPS 、2D clean 2up kit 、Auru m T MSerum Pr

11、 otein M ini Kit 、等电聚焦电泳仪、SE600垂直电泳槽、Ettan DALT 垂直电泳系统均为Amersham B i ociences 公司产品;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸购自BB I 公司;其余试剂为国产分析纯。溶液成分样品溶解液、I PG 溶胀液、平衡液、银染溶液均参照郭尧君4著蛋白质电泳实验技术配制。13方法血清蛋白质样品制备取8名受检对象空腹静脉血,室温放置30m in,离心3000×g,15m in收集血清。取60l 血清用Aurum T MSeru m Pr otein M ini Kit 处理去除血清白蛋白和I gG 。再用2D clean 2

12、up kit 或丙酮纯化,样品裂解液溶解蛋白。Lowry 法定量。双向电泳等电聚焦电泳主要按胶内加样方法进行,并参照I PGphor 等电聚焦系统操作指南5,6。S DS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS 2P AGE 分别在SE600垂直电泳槽(13c m 胶条和Ettan DAL II 垂直电泳槽(24c m 胶条中进行。2DE 图像采集与分析采用郭尧君4的银染方法并作适当改动。染色的凝胶经透射扫描用I m age Master 2D 510软件分析,不同胶匹配点相对含量的比值>2或者<015认为存在差异。差异蛋白质谱分析及数据库检索酶解后的混合物经提取肽段和自然干燥后等进行肽质

13、量指纹图谱和MALD I 2T OF 2T OF 2MS 分析,所获得图谱在I P I human数据库总中搜索。2结果2124cm I PG 胶条(pH 3-10L 的血清蛋白质图谱对照组检测到(504±49个蛋白点,ESRD 组检测到(569±47个蛋白点,2组差异点的分布如图2方框所示 。图1 对照组图2ESRD 组22条件优化后的血清蛋白质图谱对照组检测到蛋白点(287±38个,ESRD 组检测到(307±24个蛋白点。见图3,图 4图3 对照组图4ESRD 组23质谱鉴定2组间匹配点相对含量表达上有差异的共54个,任选其中4个差异点进行MALD

14、 I 2T OF 2T OF 2MS 鉴定,鉴定出的蛋白名称为KI A A1627p r otein 、transthyretin 、RNA binding motif p r otein 4、nuclear recep 2t or subfa m ily 3。3讨论血清低丰度蛋白的分离常受到高丰度蛋白、脂质、盐类等影响,而ESRD 患者由于各系统代谢紊乱使得血液成分更复杂从而影响低丰度蛋白的分离和鉴定,因此建立一个专门针对ESRD 患者血清成分变化的方案才能应用蛋白质组技术开展尿毒症蛋白质毒素的研究。本研究以ESRD 患者血清蛋白为样品,对样品制备、等电聚焦(I EF 上样量、凝胶染色等进行

15、比较和条件的优化,获得满意的ESRD 患者血清蛋白2DE 图谱。本研究首先用24c m (pH 3-10L 的胶条进行I EF,发现血清蛋白广泛分布于等电点(P I 3-10范围,对照组检测到(504±49个蛋白点,平均匹配率为78132%;ESRD 组检测到(569±47个蛋白点,平均匹配率为82131%,经I m age Master 2D 510凝胶软件分析发现差异蛋白主要分布在P I 415-615范围,如图2中方框所示处,为更清晰观察和比较ESRD 患者差异性表达的蛋白分布情况,以下研究均采用13c m (pH 4-7L I PG 胶条。本研究根据ESRD 患者体

16、内代谢变化对样品采取了如下处理:ESRD 患者因代谢紊乱导致部分蛋白产生和清除异常,与正常者比较主要是低丰度蛋白,因此有效去除高丰度蛋白对本研究尤为重要6。Auru m T MSerum Pr otein M ini Kit 能特异吸附白蛋白和I gG,经其处理后样品图谱中的低丰度蛋白分布区域显示清晰,分辨率明显提高。ESRD 患者有盐等多种小分子物质潴留在血中,样品含的这些物质将影响I EF,使电压难以达到I EF 所需,最终影响2DE效果7。本研究选用丙酮沉淀和2D clean 2up kit 纯化样品,与处理前相比这两种方法均能得到清晰的蛋白83Journal of Chinese Ph

17、ysician,January,2006,Vol 8,No1点。但丙酮处理会致血清P I6-7处蛋白丢失,影响该区域差异蛋白的比较,为确保差异表达的蛋白均能呈现出来本研究采用前者来处理样品。传统蛋白溶解液一般含有Tris,本研究发现含Tris的血清蛋白样品在I EF时电压常难达到8000伏,并出现大量水平纹。样品蛋白含量测定的准确性会直接影响I EF上样量的确定和2DE图谱蛋白点的多少,ESRD患者如果血清样品蛋白上样量太低,有可能影响低丰度表达的尿毒症蛋白质毒素比较,本研究采用的蛋白不同上样量中,100g蛋白能得到最佳的图谱效果,有差异表达的低丰度区域蛋白点显示清晰,高丰度蛋白区域又不太明显

18、。染色方法有多种,考马斯亮蓝染色虽特异性高,但上样量大,对本研究不适用,经不断摸索改良了传统的银染方案,最终得到满意的银染电泳图谱。为清晰观察ESRD患者血清蛋白质谱的分布范围,本研究首先使用24c m pH3-10L胶条为第一向等电聚焦,第二向采用垂直S DS2P AGE,Ettan DAL II垂直电泳槽系统。经软件初步分析,发现ESRD患者和正常人表达有差异的蛋白主要分布在P I415-615范围。故本研究最终采用13c m胶条进行蛋白分离,获得了理想分离效果。通过对以上几种有可能影响血清蛋白质2DE的各因素比较,本研究获得了优化的研究ESRD患者血清蛋白质图谱变化的方案,即:使用Aur

19、u m T M Serum Pr otein M ini Kit亲和吸附去除血清中白蛋白和I gG、2D clean2up kit纯化蛋白样品、使用不含有Tris的蛋白溶解液、用13c m I PG胶条(pH4-7L进行I EF、使用改良的银染方案,图3和图4是根据此方案而分别得到的正常人和ESRD患者血清蛋白2DE银染图谱。在相同条件下,分别对2组样品进行3次2DE,图谱经软件分析和数据统计后显示:正常者检测到(287±38个蛋白点,平均匹配率为84132%;ESRD患者检测到(307±24个蛋白点,平均匹配率为90155%,提示本研究采用的蛋白质2DE方案有较好重现性。

20、血清蛋白质P I和分子量分布范围很广,但与正常人相比有差异的ESRD患者蛋白点多数集中于P I415-615,表达差异的蛋白质点有54个。为明确建立的电泳方案和银染方法与质谱是否兼容,遂从54个有差异的点中随机选取4个在不同批次胶上重复性好的差异表达蛋白点进行MALD I2T OF2T OF2MS鉴定,鉴定出的蛋白为KI A A1627p r otein、transthyretin、RNA binding motif p r o2 tein4、nuclear recep t or subfa m ily3。通过对影响ESRD患者血液蛋白质组2DE各种条件的比较,可认为本研究目前建立的ESRD患

21、者血清蛋白2DE,能全面满足研究ESRD患者血清中异常表达的蛋白质,为尿毒症蛋白质毒素的研究提供了一个早期实验平台。参考文献1侯凡凡.对尿毒症毒素的新认识.中华肾脏病杂志,2003,19(2:69 -70.2H ille J M,Freed AL,W atzig H.Possibilites t o i m p r ove aut omati on, s peed and p recisi on of p r oteome analysis:a comparisi on of t w o-di m en2 si onal electr ophoresis and alternative.Ele

22、ctr ophoresis,2001,22(5: 4035-4052.3叶任高.慢性肾衰竭.见叶任高,内科学.北京:人民卫生出版社, 2001,569-579.4郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京:科学出版社,1999,141-142.5Elisabetta G,I vano E,Anna A,et al.A Pr oteom ic I nvestigati on of Is o2 lated Soy Pr oteins with Variable Effects in Experi m ental and Clinical Studies.J Nutr,2003,133(1:9-14.6Rac

23、hel A,Craven,NT,Patricia H,et al.Laser Cap ture M icr odissecti on and T wo-D i m ensi onal Polyacryla m ide Gel Electr ophoresis:Evaluati on of Tissue Preparati on and Sa mp le L i m itati ons.Am J Pathol,2002,160(3:815-822.7屠成剑.样品的全息制备.见夏其昌,蛋白质化学与蛋白质组学.北京:科学出版社,2004,263-264.收稿日期:2005-08-29(上接第33页2

24、Yu XQ,W u LL,Huang XR,et al.O steopontin exp ressi on in p r ogressive renal injury in re mnant kidney:r ole of angi otensin.Kindey I nt,200, 58:1469-1480.3Wolt m an AM,de Haij S,Boonstra JG,et al.I nterleukin-17and CD40 -ligand synergistically enhance cyt okine and che mokine p r oducti on by renal ep ithelial cell