第五章 放射性药物

1、第五章 放射性药物 凡进入体内的，用于诊断或治疗的放射性核素及其标记化合物统称为放射性药物(radio pharmaceuticals)。放射性药物实际上也是放射性核素标记化合物一个重要部分，只不过对它的要求更为严格。它与临床核医学的关密更为密切。§1 放射性药物的临床应用一、诊断药物主要利用放射核素放出的射线。 (一)用于脏器显像 利用放射性核素进入体内的蓄积选择性和脏器病变组织对放射性药物摄取的差别，通过显像仪器来显示出脏器或病变组织的影像，供临床诊断。显像仪种类很多，如：简单扫描仪、照相机、发射型计算机断层（ECT）,正电子发射型计算机断层（PET）。显像分为动态和静态两种方式

2、。还有平面和断层显像，可得到脏器三维立体图像。 (二)用于功能测定：给病人口服、注射或吸入某种放射性药物，在体外用功能仪直接测量或测量血、尿、大便的动态变化，可反映脏器的功能状态，如甲状腺、肾、心肌、胰腺等功能测定。 (三)XCT和ECT的比较：二、治疗药物主要是利用放射性核素放出的射线或射线能引起电离反应，达到抑制和破坏病变组织而进行治疗。§2 对放射性药物的要求一、具有合适射线类型和能量：用于显像诊断的放射性药物中的放射性核素应是发射射线或正电子(+)，最好不发射或少发射-、射线，以减少机体不必要的辐射损伤。其射线发射机率要高，每100个衰变能给出95100个光子，这样信息密度就

3、高。射线能量最好在100300 kev，此范围射线适合扫描机、相机和SPET的测量。如是用于治疗，应选-或射线，不发射或少发射射线，以提高治疗效果。射线的能量-应在1 Mev以下，应在6Mev以下。二、具有合适的物理半衰期：诊断用放射性核素的T1/2要在满足诊断检查所需时间的前提下尽可能的短，以减少病人的受照剂量。目前临床上诊断用放射性药物的核素T1/2大多在几小时至几天，条件好的医院已用T1/2在几分钟的放射性药物。治疗用的放射性药物T1/2不宜太短，一般在1到8天，以保证疗效。三、毒性小：要求进入体内的放射性核素及其衰变产物的毒理效应小，若有毒性，应用时要严格控制在无毒性反应的范围内。最好

4、核素的衰变产物是稳定性核素。另外，放射性药物的核纯度、比活度及放化纯度高，不仅能提高药物效果，还能减少毒副作用。§3 放射性药物的摄取机制 放射性药物进入体内，在显像、功能测定及治疗中，都依据其摄取的机制，主要有以下七个方面： (一)功能性吸收与排泄：脏器的某些细胞，由于各种各样的原因，能选择性地吸收某种放射性药物，并通过某些组织器官排泄或分泌。在此过程中放射性药物未经受代谢变化，如肾小管上皮细胞对131I-邻碘马尿酸的吸收、99mTC-DMSA被肾小管吸收并经肾脏排泄等，这就是肾功能测定和肾显像的机制。所以，放射性药物在某些组织器官中吸收的数量、速度以及分布情况，可以反映疾病时功能

5、和形态的改变。所吸收的放射性药物，还可能对某组织器官造成过量照射而实现对疾病的治疗。 (二)运转及参与代谢：通过某些药物的主动转运参与细胞内的有关代谢过程研究特异器官的功能,进行功能测定或显像。例如，用131I检查甲状腺功能，当碘化物进入体循环时，被甲状腺细胞摄取。59Fe参与血红蛋白合成而浓集于骨髓。75Se被胰腺吸收和利用并使之显像。这些机制都是运转及参与代谢。 (三)离子交换作用：99mTC-焦磷酸盐用于骨显像，是因为焦磷酸盐能与骨中PO3-4交换，实现浓聚而进行显像的。这是由于该显像剂从血液弥散入细胞外液，骨的多孔的矿化表面被此液所包围，磷酸酪合物迅速地通过离子交换固定于骨的固相，并掺

6、入羟基磷灰石晶格中，在骨的活性和血流增加的部位(如正愈合的骨区、原发或继发肿瘤区)，放射性浓度增高，这就是骨显像的机制。 (四)简单的弥散和分布：将放射性药物引入体内某空间，可显示该空间的大小和形态。例如放射性惰性气体133Xe(133氙)从呼吸道吸入或以其生理盐水溶液的形式静脉注入，均可弥散至肺泡内，进行肺功能测定及显像。若将24Na或32P皮内注射，放射性通过弥散进入微血管而从局部清除，其半清除时间亦反应局部血流情况，整形外科常用此法测定管状皮瓣的血运等。 (五)细胞吞噬和胞饮作用：当细胞与环境中某种物质的颗粒接触时，如果适合细胞功能的要求，细胞膜与颗粒接触的部分便开始内陷，其周围则伸出伪

7、足，并逐渐将颗粒包住，最后以膜包颗粒的形式进入细胞。如果进入的颗粒是固体物则称吞噬，进入的是液体则称胞饮。肝、脾、骨髓的内皮系统具有识别和吞噬外来颗粒的功能。故放射性药物集中于这些器官而显像。例如，利用脾脏的网状内皮细胞可吞噬衰老，死亡的红细胞，故用标记的变性红细胞进行脾显像。利用白细胞有吞噬胶体颗粒的功能，故可用放射性胶体标记白细胞，借此进行浓肿和血栓定位诊断等。 (六)毛细血管阻断：放射性大颗粒聚合白蛋白或微球，当其颗粒直径超过肺毛细血管直径(10m)时，在静脉注射之后无法通过肺毛细血管，而造成暂时性的均匀性栓塞，其分布与肺血流成比例，由此可观察肺内血流情况，用于肺显像。小部分小血管阻塞、

8、几小时后颗粒自行降解。 (七)特异导向结合：根据受体与配基、抗体与抗原结合具有高特异性，高亲和性的特点，用适当的放射性核素标记的配体或抗体，使之导向到含有高密度受体或抗原的靶器官或靶组织，达到显像或治疗的目的。例如用11C-去甲肾上腺素与心肌肾上腺素能神经末梢结合，浓集于心肌。123I-IBZM是多巴胺D2受体阻断剂而显示脑内部位D2受体分布位置与数量。99mTC标记抗CEA单克隆抗体及131I标记AFP抗体，可分别进行结肠癌和肝癌的诊断治疗。131I标记抗人精浆蛋白抗体用于前列腺癌转移灶的显像等。§4 放射性核素发生器 放射性核素发生器(radio nuclide generato

9、r)：是一种从长半衰期放射性核素(母体)中分离得到短半衰期的衰变产物(子体)的一种装置，俗称母牛(cow)。一、基本特性 (一)放射性衰变和生长的相互关系：在目前所发现的两千多种放射性核素中，多数核素的衰变并不产生稳定核素，即衰变的子体产物仍然是放射性核素，这就使得一些相关的放射性核素之间构成了“衰变链”。放射性核素发生器就是把特定的衰变链中某一个所需的放射性核素从它的母体中分离出来的装置。由于母体和子体之间半衰期的差别，这种分离可以以一定的时间间隔反复多次地进行，直至母体衰变完，就好象母牛可以每天按时挤奶一样。 (二)理想的医用核素发生器的条件：各种放射性核素之间构成的衰变链为数众多，但不是

10、都可以来制备核素发生器。一个“理想的”医用放射性核素发生器必须满足一定条件，主要有： 1、母体核素应有足够长的半衰期，以保证制成的发生器有足够长的使用寿命，且要求母体核素易于制备，成本低。 2、子体核素具有较短的半衰期，能发射适宜于体外探测的中能射线或特征X射线，子体核素的再衰变产物应为稳定核素或放射性活度很低的长半衰期放射性核素。 3、子体核素具有活泼的化学性质，其化学形态具有高的放射性纯度和放射化学纯度，以及高的比活度。 4、发生器的结构简单，操作简便、快速、安全及产量高且在短期内可重复使用。 5、无菌、无热源、符合国家药检标准。目前应用最广泛的核素发生器是99Mo-99mTc与113Sn

11、- 113mIn两种。 99Mo-99mTC发生器大都采用裂变产物所获得的99Mo，先纯化处理成(钼酸铵)(NH4)2 99MoO4溶液，将其注入发生器玻璃层析柱内，柱内预先装入Al2O3吸附剂约510 g，颗粒为200300目，并用PH4.3±0.5，0.01 mol/L的HCl液平衡冲洗。99Mo2-4有二个离子电荷，与Al2O3结合较牢固，而衰变子体99mTCO4-只有一个离子电荷，结合较弱。用灭菌生理盐水淋洗可以把结合弱的99mTCO4-洗下，99MoO2-4仍留在柱上。灭菌生理盐水不仅洗脱效率高(70%80%)，而且收集到的洗脱液不必调PH即可口服或注射。1、铝罐，2、玻璃

12、交换柱，3、筛板，4、淋洗液排出管，5、钼酸锆胶体，6、生理盐水进口接头，7、8、14、连接胶管，9、空气过滤，10生理盐水瓶，11、发生器提把，12、小铝罐，13、淋洗液收集瓶，15、淋洗液出口接头，16、装料管头，17、塑料外壳二、锝的放射性药物制备。（略）三、锝标记药物的应用。（略） §5 放射性药物的质量检验和管理一、放射性药物的质量检验（一）物理检验 1、物理状态：从颜色和透明度及大小合适的颗粒度考虑。 2、放射性核素纯度：要求大于99%。 3、放射性活度：适宜的活度、尤对儿童、孕妇、哺乳妇用药剂量要慎重。（二）化学检验 1、放射化学纯度：要求大于95%。 2、化学纯度：常

13、采用光谱法测定。 3、PH和离子强度：理想的放射性药物的PH值应为7.4的等渗溶液。（三）生物检验1、无菌检验和灭菌：一般采用微生物培养法进行无菌检验。可采用高压灭菌或过滤除菌，根据药物性质采用不同方法。2、热源试验：热源是注射后导致发热反应的毒素，主要是细菌内毒素。放射性药物在制备过程中要防止带入热源物质。3、毒性试验：放射性药物的主要毒性是辐射损伤，这种损伤程度可以由估算内照射吸收剂量来判断。二、放射性药物管理 1、放射性新药的管理：放射性新药是指我国首次生产的放射性药品，已生产的放射性药品，凡增加新的适应证、改变给药途径和改变剂型亦属新药范畴。放射性新药的研制内容包括工艺路线、质量标准、

14、临床前药理及临床研究。 2、放射性药品生产、经营的管理：放射性药品生产、经营的单位必须持有相应的许可证。1、 放射性药品使用的管理：须符合放射性同位素卫生防护管理有关规定。第六章 放射性核素示踪技术 放射核素示踪技术是利用放射性核素及其标记化合物作为示踪剂，应用射线探测方法来检测它的行踪，以研究示踪剂在生物体系或外界环境中运动规律的核技术。§1 放射性核素示踪技术的原理及特点一、基本原理 放射性核素示踪实验的原理基于两个方面：一是放射性核素及其标记化合物和相应的非标记化合物具有相同的化学及生物学性质；二是它们之间有不同的物理性质，即放射性核素能发出各种不同的射线，可被放射性探测仪器所

15、测定或被感光材料所记录。二、主要特点 1.灵敏度高：最精确的化学分析只能测10-12 g水平，而放射性示踪技术可测出10-1410-18 g水平，因而对研究体内或体外实验系统内的微量物质具有特别价值。 2.检测方法简单多样。3.合乎生理条件：许多被研究的物质是系统内原有的成分，并且通常处于动态平衡状态，其含量及分布维持稳定状态。如果引入该物质量少而无标记，则其很快即由内源性物质所稀释而失去踪迹；如果引入该物质为大剂量则造成系统内含量异常，此类实验不是生理性的。用放射性核素及其标记化合物所用示踪量足以用核探测仪器测出，但是其化学量可以是很少的，引入后几乎不会改变体内原有物质的含量，所以基本上不会

16、改变体内或体外系统的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状态物质的变化。4.能定位和定性。比如利用RAG可检测示踪剂在组织、细胞内的分布情况等。三、基本类型、方法及注意事项 (一)类型：根据实验的目的不同，可分以下几种类型： 1.整体示踪实验：指将标记物引入完整的机体，从体外或取标本观察标记物的去向，以了解机体在生理、病理过程中物质的分布及运动转化规律，主要用于研究物质在体内的吸收，分布、代谢和排泄等运动规律以及研究机体组织器官的功能和形态变化。2.离体示踪实验：指从整体中分离出来的组织或细胞等简单系统进行的实验。多用于某些特定物质如蛋白质、核酸等的转化规律以及某些精细结构的功能研究。3.双标记

17、示踪实验：其原理就是将两个研究对象包括两种分子或是一种分子的两种形态或是一种分子的两个部分，分别带上示踪原子，通过采用相应的测量方法，分析两种标记原子的量，观察它们经过运动转化前后比值的变化，判断该两种观察对象是否具有相同的运转规律。 (二)实验方法及应注意的问题1.实验准备阶段 (1)实验类型的选择(补充)：其选择的原则有： 研究整体吸收、分布、转运、排泄等问题，只能选择整体示踪实验。 物质在精细结构中的运动规律，可首先考虑离体示踪实验，最好有整体实验加以验证。 物质转化的研究以离体实验为宜，必要时也应加以整体示踪实验。 直接观察细胞内的物质转化，而且该物质的标记物又无法直接引入细胞时，可以

18、选择脉冲标记法，也可以用加入示踪物的前身标记物法，该前身标记物进入细胞，在细胞内发生“示踪物前身示踪物代谢产物”的转变，获得“示踪物代谢产物”的信息。对于某些研究，用离体实验方法易导致错误结论，或离体实验本身的短时性不能给出应有结果时，应采用整体实验。(2)标记物的选择：针对不同的实验类型、实验目的及实验周期从以下几个方面考虑： 射线类型：体内示踪实验宜选用射线发射体，如131I、99mTc；离体示踪或取样进行离体测定的研究则多选用射线或低能射线发射体，如3H、14C及125I等。 半衰期：体内示踪实验一般选用短半衰期核素，体外示踪实验可用半衰期长的放射性核素。 放化纯度：必须经过纯化鉴定、放

19、化纯度>95%。比活度：根据示踪实验灵敏度要求选择适当的比活度，整体示踪实验时，标记物的引入基本不改变该物质的体内含量，同时要求能经得起体内的稀释，使放射性测量的统计误差在允许范围内。当研究的物质含量极微时，要求使用无载体高比活度的示踪剂。离体实验条件下，既要考虑到高比活度的标记物可以提高分析灵敏度，但又要考虑到比活度过高的标记物不仅其严重的辐射自分解使其自身不稳定，还可能造成对实验系统的辐射损伤效应，尤其是需要较长时间培养的细胞系统。标记位置的选择：物质转化的示踪研究要求采用定位标记示踪物，而目标记物在代谢过程中应稳定、不脱落。当研究的目的只是观察标记物的去向，而不管其代谢产物，就不需

20、要严格定位的标记物。 (3)选择合适的测量方法：通常根据选用的核素发射的射线种类确定用何种方法测量。如固体闪烁测量，液体闪烁测量、放射自显影等方法。双标记要用双标记方法测量。2.实验阶段 (1)示踪剂量的估算：示踪剂量的估算不能用简单的公式来估算，应该综合考虑。 稀释作用：放射性核素标记化合物进入机体后，一般要求放射性活度在整个实验过程中，经稀释后所制得的放射性样品不能低于本底计数，必须满足下式：A·C·E/D>B式中：A.示踪剂的比活度 C.示踪剂的用量 E.测量效率 D.稀释倍数 B本底组织的浓聚作用：由于某些放射性核素有亲某种组织的特性，有的放射性核素进入机体后

21、不是完全均匀被稀释，而可能选择性地蓄积到某些器官、组织而浓聚。如131I进入体内后，有30%或更高可被甲状腺摄取，给予剂量时就要考虑这个特异性。 实验周期及安全剂量：根据试验周期长短，实验分析方法，给予途径等进行安全剂量估算。如，示踪剂引入机体，要求基本不改变该物质在体内的浓度。药物研究时其化学量不应超过临床剂量，动物实验时在不中毒的前提下可适当增大剂量。体外示踪实验可用比活度较低的标记物。 对于非均匀分布的标记物还应根据实验情况(实验周期长短、标记物的生物半衰期，标记物在拟观察的脏器中分布的百分数，能取得的样品量，测量上最低需多少dpm等)作一系列估算。(2)示踪剂引入途径：根据实验类型和目

22、的，对整体动物实验可采用静脉、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌胃等。(3)放射性样品的制备：样品的制备就是为测量服务，测量的形式主要有三类：取标本在体外测放射性；制成不同水平的切片作放射自显影；从体外测整体内的放射性。因此样品制备就要适应不同测量类型。(4)数据处理：放射性示踪实验结果可根据不同目的选用不同参数表示，含义也各不相同，概括为以下几种。 整个脏器的总放射性活度：主要用于研究物质分布的实验以反映各脏器的相对分布量。对于不同个体的同一脏器来说，该参数与各个体接受的剂量成正比，故各个体的剂量不同时应换算成所给剂量的%，或对剂量进行校正。 放射性含量：dpm/mg组织或ml体液、dpm/m

23、g蛋白或DNA等。用以反映不同组织浓集某种物质的能力。对不同个体来说，该参数与单位体重接受的剂量成正比，故要求各个体接受的剂量按单位体重计算是相等的，否则应作相应的校正。比活度：dpm/mmol或mg化合物。主要用于研究内源性物质的动态分布或代谢。它受三个因素的影响，即与引入的放射性活度成正比；与组织中非标记物含量成反比；与示踪物被清除的速度成反比。相对比活度：两个解剖部位中同一化合物比活度的比值或两种化合物比活度的比值。用于反映组织中某物质的来源及组织与血液交换的速率，可排除血液中比活度不恒定的影响。四、示踪实验中的同位素效应 (一)同位素效应的概念：物质转化时，如分子中某一原子被它的同位素

24、所取代，虽然反应性质不变，有时却会发生反应速度的改变，称为同位素效应(isotope effect)。 (二)同位素效应的类型 1.初级同位素效应：反应直接涉及同位素所在的键时，同位素效应比较严重，称初级同位素效应(primary isotope effect)。 2.次级同位素效应：同位素效应发生在邻近的化学键称继发同位素效应或次级同位素效应(second isotope effect)。 3.溶剂同位素效应：溶剂中某种原子被同位素取代后影响溶质的反应速度称之。 4.生物体系的同位素效应：示踪剂引入生物体后，由于同位素效应的存在会影响有关的各种生化反应，这种情况称为生物体系的同位素效应。&#

25、167;2 放射性核素稀释法一、概念 放射性核素稀释法(radionuclide dilution technique)即用适当的放射性核素标记化合物作为示踪剂，利用化学上的稀释原理对微量物质作定量分析，或测定液体容量的方法。二、基本原理 依据化学物质在稀释前后质量不变的原理，放射性物质在被稀释前后，其放射性活度也不会改变。但是，由于被稀释，它的单位质量或体积内的放射性活度(即比活度或放射性浓度)降低了。设质量为m1的标记物的比活度为s1与质量为m2的同一种化学形态的非示记物均匀混合，则标记物被非标记分子所稀释，混合物的比活度为s2，混合前后的总放射性应相等。即： s2(m1+m2)=s1m1

26、(61) 如果m1和m2中有一个量为已知，只需测定混匀后样品(取任意量)的比活度，就可算出另一量。三、基本方法 (一)核素正稀释法(direct nuclide dilution)：用已知量的标记物测定未知量的非标记物的稀释法称为核素正稀释法。方法要点是：将一定量已知比放射性的标记化合物与其非标记化合物的分子均匀混合，直接测定该混合样品的比放射性，亦可进行提纯后测定该样品的比放射性。根据比放射性的降低来计算非标记化合物的含量。设：m1标记化合物的量；A标记化合物的放射性；S1标记化合物的比活度；S2稀释后混合液的比活度；mx样品中待测化合物的量根据公式 S2(m1+m2)=S1m1得： mx=

27、m·(S1/S2-1)这是正稀释法的基本公式。 示例某样品内含有微量磷酸钠(Na3PO4)，加32P标记的磷酸钠(Na332PO4)0.05 mg，其放射性计数为1950 cpm，混匀后分离得纯品磷酸钠0.1 mg，放射性计数为600 cpm，求样品中磷酸钠的含量。解：已知A=1950 cpm, m1=0.05 mg, S1=1950/0.05=39000(cpm/mg)S2=600/0.1=6000 cpm/mg,代入式62得：mx=0.05×(39000÷6000-1)=0.275 mg (二)核素反稀释法(inverse nuclide dilution)：

28、用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的方法称之为核素反稀释法。方法要点是：在体内示踪实验时，设标记物的化学量为mx，已知标记物的比活度为S1，加入非标记物的化学量为m，均匀后分离出纯品(标记物+非标记物)的比活度为S2，根据稀释法的基本公式(62)，得：mx=m S2/S1-S2 (63)这就是反稀释法基本公式。凡是标记物在样品中的化学量少，并混有放射性杂质，欲求其含量，只要知道该标记物的比活度，都可用反稀释法进行定量。 示例用14CO2通过植物光合作用生成放射性蛋白质，取其中少量蛋白质经水解后分离出部分谷氨酸测得比活度为254 dpm/mg，欲求谷氨酸的含量，取126 mg放射性蛋白样品，

29、水解后加入非标记谷氨酸10.7 mg，混匀后分出少部分谷氨酸测比活度为382 dpm/mg。求标记谷氨酸的量及蛋白中标记谷氨酸的重量百分比?解：已知m=10.7 mg S1=508 dpm/mg S2=382 dpm/mg，代入公式(63)得mx=10.7×382/508-382=32.44 (mg)标记谷氨酸的量，则标记谷氨酸的重量百分比为：32.44÷126=25.7%。(一) 核素双稀释法(double nuclide dilution)：（略）（二）放射性核素稀释法的应用 放射性核素稀释法当初建立时，曾大量用于体外样品的定量工作。但自从灵敏度更高的放射免疫分析方法及

30、由此发展起来的非放射性分析方法推广以来，现已较少使用。但是在某些领域，核素稀释法仍有不可取代的优越性。一是测定生理性物质的体内代谢库或测定整体内各种体液成分的量，二是作为考核其它超微量分析方法可靠性的参比。 1、测定生理性物质的体内代谢库 体内各种生理性物质都有各自的分布范围，每个分布范围称为一个代谢库。利用同位素稀释法来测定活体各代谢库的大小几乎是绝大多数物质整体代谢库的唯一有效方法。例如静脉注射少量高比活度的3 H-胆酸，待其在包括血浆在内的代谢库混匀后取样测比活度，按稀释法原理即可算出体内包括血浆在内的胆酸代谢库的大小。 2、整体内各种体液成分的量 整体内有些体液成分的量也相对恒定，它们

31、不一定是一种特定物质，因此习惯上不称为代谢库，但是它们的变化有理论意义和临床实践意义。测量它们总量的唯一办法也是同位素稀释法。下表是常用的几种体液成分测量法。四、建立核素稀释法的条件(注意事项) 1.标记物或非标记物与待测物质在化学性质上要相同。 2.实验过程中，标记原子在化合物上要稳定，否则测定的比活度不准确。 3.标记物的放射化学纯度要高。 4.必须确保标记物与非标记物充分混匀，特别是体内稀释实验时，由于有吸收、扩散等因素，完全混匀的时间，一般需经实验确定。 5.对混匀后的样品，要有可靠的分离、纯化方法。因为混匀后，样品的比活度恒定，所以样品的丢失不影响结果的准确性，可采用各种理化的方法进

32、行纯化，以确保分离的样品纯净，测得可靠、准确的比活度。 §3 物质转化的示踪研究 研究物质转化的目的要揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物、及产物的关系，以完成某种转化的必要条件。该方法是目前最常用最理想的方法之一，可以在整体、离体的条件下进行，不但能够对前身物、中间物，产物作用定性分析，还可用来研究前身物转化为产物的速度，转化的条件，转化的机制及各种因素对转化的影响等。一、掺入实验(incorporation experiment) (一)基本原理：要研究生物体系中化合物A和B是不是前身物和产物的关系，可将A的适当部位用放射性(或稳定性)核素标记。进入生物体系(整体或离体组织)后

33、一定时间，分离出B。如在B中出现较多的标记核素，说明A的标记原子、标记集团或整个标记分子已参入到B中，即证明化合物A是产物B的前身物。(二)主要参数：最常用的参数之一是掺入百分率(incorporation percen rate)，表示引入的前身物分子能转变为产物的百分率，亦称相对参入量，可对前身物和产物的关系作出定量测定，按下式计算：掺入百分率=产物的总放射性/前身物的总放射性×100%，上式中产物的总放射性并不反映前身物转化为产物的总量，这是因为标记前身物进入生物体系后往往被内源性前身物所稀释，而后者形成的产物不带放射性，因此，形成的非放射性产物越多，产物的总放射性反而越低。为

34、排除产物和前身物分子量不同的影响，通常用比活度来表示各自的放射性，即毫(微)克分子的放射性，然后再计算它们的比值来反映它们的相互关系，这种关系就称为相对比活度(relative specific activity)，按下式计算：相对比活度=产物的比活度/前身物的比活度式中的前身物比活度是指标记前身物与内源性前身物混匀后的测定值，两者应同时测量。相对比活度反映的是前身物转化为标记产物的速率，或称标记前身物的利用率，即掺入率(incorporation rate)。(三)掺入实验的类型1. 整体(in vivo) 掺入实验：多数采用实验动物，选用适当的标记物也可在人体内进行。整体实验有利于观察某一

35、物质在体内转化的全貌，某些酶系统作用的研究有时只能在整体进行。如果实验设计合理，整体参入易于得出最后结论。但由于体内有循环交换及代谢旁路，不易弄清转化过程的细节。 2. 离体(in vitro) 掺入实验：研究物质转化过程的细节常采用离体掺入实验，实验条件易于控制，有利于在分子水平阐明转化过程的具体步骤，转化条件及影响因素。一般用于离体掺入实验的生物材料主要有组织切片、组织匀浆、游离细胞、 亚细胞颗粒或无细胞酶系统，要求研究材料保持生理活性，至少在进行实验期间能与引入的标记物相互作用。应用较多的是组织匀浆。必须注意的是：离体实验得出的结果只能看作是提出了一种可能，应作综合评价。(四)基本方法

36、1.选择合适的标记物。根据待测代谢物的特定，选用适当前身物并在一定部位进行标记。 2.将标记物引入生物体系。 3.分离产物。根据不同情况采用不同的分离方法，提取的产物最好制备成溶液。 4.测量产物。放射性测量及物质定量，由此求出比活度。(五)要求与条件 1.标记前身物用量是示踪量。比活度尽可能高，保证测量结果准确可靠。 2.放化纯度要高(>95%)。 3.分离的产物要求达到放化纯。(六)应用实例淋巴细胞转化实验。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA合成的前身物。人外周血T 淋巴细胞在PHA（植物血球凝集素）的刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄取 TdR用以合成DNA。与此同时，

37、3H-TdR也不断地被摄入细胞内而被放射性标记。通过液闪计数测量，可了解淋巴细胞增殖活动的情况，借以了解机体的细胞免疫功能。如果用于肿瘤细胞，可以反映活动周期肿瘤细胞的数量或细胞的增殖活力，对研究肿瘤的发生、发展，疗效观察及预后判断具有重要的意义。常用结果的表现形式：3H-TdR掺入百分率、刺激指数（刺激组与对照组DNA的放射性之比）。细胞周期：G0期（休止期）-G1（DNA合成前期）-S（DNA合成期）-G2（DNA合成后期）-M（分裂期）§4 物质吸收、分布及排泄的示踪研究一、物质的吸收示踪实验 (一)物质吸收百分率：为了尽可能如实反映整体的吸收率，通常都采用整体示踪技术，尤其以

38、研究消化道的吸收率更为普遍。常用方法有： 1.观察未吸收的残余量法：示踪物一次口服或灌胃后，收集含该示踪物的全部粪便(通过预实验确定收集天数)，测定其在粪便中的残余放射量(令该示踪物吸收后经消化道排出量可以忽略)，则吸收百分率=(摄入量-残余量)/摄入量。 2.整体计数法：若已知某示踪物在体内更新很慢，待粪便中放射性排完后用计数器从体外作整体放射性测量，则吸收百分率=整体放射量/摄入放射量。 3.测定血浆中示踪物含量法：示踪物一次静脉注射后全部进入血浆，随之血浆内示踪物浓度因清除(组织分布、代谢、排泄等)而逐渐下降。口服示踪物后的血浆示踪物浓度则是一边吸收一边清除的结果。为此，可用测定示踪物血

39、浆浓度时相曲线下的面积(Area Under Curve, AUC)来表示吸收率。 若用相同剂量的同样示踪物分别作静脉注射和口服实验，且已知血浆清除速度相同，则口服与静脉注射两个时相曲线的AUC比值，称为绝对生物利用度(Absolute Bioavailability)；两种方案(不同剂型，或作不同处理)口服时的AUC比值，称为相对生物利用度(Relative Bioavailability)，见图6-1a,b。 血浆含量法应注意的问题：应将血浆中的原示踪物与其标记代谢物分开，以原示踪物的含量为=依据。为了排除血浆清除速度不同的差异对实验结果的影响，最好用双标记示踪法，即以同一物质的两个示踪剂

40、在同一时间以不同途径或不同口服方案引入同一机体，以双标记测量技术求出相应的两个AUC。若两个示踪剂的引入量不同，AUC应归一化，即换算成各自剂量的%。 4.测定尿排出量法：对于经肾脏排出的物质，一次口服示踪剂后，测定一定时间内经尿排出的总量，也能反映吸收率。但此法受多种因素影响，如体内代谢、贮存及肾功能状态等，故使用此法时要周密设计，采取一些特殊措施，否则结果的可信度较差。 (二)物质吸收时化学形态的示踪研究(自学)。 (三)物质吸收部位的示踪研究(自学)。二、物质分布示踪技术 物质分布是研究结构与功能相互关系的前提，有宏观、细胞、亚细胞及分子等四个不同水平。它们的基本方法包括以下三个步骤：

41、1.引入示踪剂：根据要求达到的不同水平与信息的可靠程度，而采用相应的引入途径。宏观水平(即器官水平)用整体示踪实验，以静脉注射(小动物可用腹腔注射)为宜；对亚细胞和分子水平的研究，观察对象是精细结构或大分子标本，静脉注射则不易达到具有足够示踪物量的要求，故采用试管内给予示踪物法或由特殊途径给入，例如用脑室注射法，以观察标记神经递质的分布。 对示踪剂的要求也视研究目的和达到的水平不同而有差别，首先，因为观察目的是分布而不是转化，故不需要严格定位标记的示踪剂，但不可存在有可交换的示踪核素，否则在体内会发生非代谢性交换而使部分标记原子脱落；其次，对标记物的放射化学纯度有严格要求，对于原料不纯(如不药

42、有效成分)或放化纯度不高的示踪剂，其实验结果的可信度差。此外，对比活度的要求，也视观察水平的不同而有不同的要求。器官水平的可低些，亚细胞及分子水平的则应有高比活度的示踪剂。 2.观察分布的方法：观察方法有放射自显影技术和取标本测含量等两类方法，有时为获得更可靠的结果，可以将两类方法结合使用。无论何种方法都应区分原示踪物和标记代谢物给出的信息，并注意时间因素对分布的影响，即选择合适的观察时相。 3.数据处理：为了保证结果的可比性，必须选择合适的参数。现以取标本测定放射性为例，说明参数选择问题：放射性活度应以dpm表示，若探测效率相同时，也可用cpm。以下问题应予注意：为了反映组织或组织内某一组分

43、的浓集程度，应将测得的dpm用以下方式之一表达：dpm/组织或dpm/ml体液(器官水平)、dpm/细胞数(细胞水平)、dpm/mg蛋白或DNA(亚细胞水平)、dpm/mg核酸或蛋白(分子水平)。由于组织或组分的浓集程度还与接触的示踪物含量有关，若每克体重的示踪物剂量不同，则不同个体相互比较时，应作以下校正：1)将测得的dpm除以每克体重的示踪物剂量，或2)同时测定血浆中放射性含量，再以各组织或组分中的放射性含量除以血浆中放射性含量。当以全脏器的dpm换算为引入示踪剂的百分数表达时，由于该参数不仅与脏器浓集力有关，还与脏器大小有关，故不能直接用它来比较不同脏器对示踪剂的浓集力。但可作为脏器的功

44、能性指针，例如肝硬化时，摄取某些标记色素的百分数降低。至于物质分布研究的应用自己看看。三、物质转运示踪技术 核素示踪是研究物质转运的最重要手段之一。与物质分布示踪技术一样，有不同水平的层次，也同样用ARG和取标本测示踪物的放射性两类基本方法。其主要特点是更强调动态观察，而且往往要同时附加一些特定的处理，通过互相参比来说明转运性质及机制。 (一)血浆组织间的转运：基本方法是向血液引入示踪物，不同时间取组织或/及血液测定示踪物含量。根据不同的研究目的，主要设计方法有以下几种： 1.动态平衡的证实：某物质在组织内含量恒定，但能与血液中的该物质进行交换，即处于组织、血液之间的动态平衡状态。为证实这个事

45、实，可将该物质的标记物引入血液，若组织中出现放射性，说明标记物由血液进入组织；若停止向血液引入该标记物，组织中的放射性则逐步下降。 2.组织中物质来源判别：同位素平衡实验可以证明组织(细胞或亚细胞结构)中的物质是否全部或部分来自其周围环境(血液、培养液或胞浆等)。设计方法及原理：将被研究物质的标记示踪物引入“环境”后作动态观察，若该物质全部来自环境，则示踪物在组织内外达到动态平衡后，其组织内、外的比活度比值(相对比活度)应为1；若全部由组织自身合成，则组织内放射性比活度比组织外小，相对比活度小于1。3.血浆运载蛋白研究：某种物质在血浆中被转运，是以游离形式或是某些特定的血浆蛋白相结合的形式，可

46、以用核素示踪法加以证实。方法也很简便，将被研究物质的示踪物引入血液中，再取血分离血浆，作血浆涂片ARG或作放射性扫描，先在电泳谱或层析谱上找出这种运载蛋白，再作进一步的性质分析。 (二)生物膜两侧的物质转运：生物膜包括细胞膜，以及亚细胞颗粒成分与胞浆间的接口结构。生物膜两侧的物质转运，除了单纯扩散外，还有在膜结构中的某些蛋白质帮助下，形成易化扩散以及在某些耗能“泵”作用下的逆转运(由低浓度侧向高浓度侧转运)，称为主动转移。因此，生物膜两侧的物质转运，不仅有利于营养物质和代谢产物的运输，而且与细胞的生理活动密切相关。核素示踪法是研究这类转运的重要的甚至是不可缺少的方法。 1.单纯扩散研究：将标记

47、物加于生物膜的一侧，观察另一侧的放射性以判断扩散速度。脂溶性强弱和分子量大小，是决定单纯扩散快慢的两个主要因素。药物的血脑屏障研究就使用这种方法。 2.易化扩散和主动转运研究：根据研究目的不同而有不同的实验设计。对于有腔脏器如肠道，可取出翻转并结扎两端，在体外培养中作示踪实验，既可以观察转运速度，还可以人为地造成浓度梯度、缺能、缺钠等条件以分析转运机制。对于一些实质性器官的细胞膜转运，则通过浆细胞在含有示踪剂的培养液中培养，观察示踪物向细胞内转运速度及转运量；若把已经达到同位素平衡的细胞移至无示踪剂的培养液中继续培养，则可观察物质由细胞内向细胞外转运。还可以改变培养条件来观察细胞内转运或外转运

48、的净变化。方法是：让细胞在有标记物的培养液中达到同位素平衡，然后在不移去细胞外标记物的条件下加入影响细胞活动的因素，再分离细胞测放射性作动态观察(即作时相曲线分析)。 (三)亚细胞水平的物质转运研究：为了说明亚细胞结构间的物质转运与细胞机能调控之间的关系，需进行亚细胞水平的物质转运研究。常用电镜ARG动态观察或分离亚细胞组分作放射性动态测量，还可以通过制备亚细胞结构间物质转运模型，即用一定的化学处理破坏细胞膜的特殊转运机制，但不打碎细胞，可以得到上述模型。例如用皂甙处理肝细胞，使其胞膜对胞浆中的成分能自由通透。这样一来细胞内的示踪物量反映颗粒性亚细胞结构中的示踪物含量，故而可以从改变培养液中的

49、影响因素设计中，分析这些因素在细胞调控机制间的相互关系。§5 细胞动力学的示踪 细胞动力学(Cell kinetics)是研究生物体内各类细胞的增殖、分化、消亡过程的规律，包括处于各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置、细胞迁移途径及更新等。对某些疾病的诊断、治疗及估计预后有重要意义。 细胞动力学的研究方法主要有两大类，即放射性核素标记示踪和非核素标记示踪。后者又包括有丝分裂阻断法及细胞光度测量法，下面侧重介绍放射性核素标记示踪。一、示踪原理 处于S期的细胞因需合成DNA，故可摄取DNA的特异前身物胸腺嘧啶核苷(TdR)合成到新的DNA分子中，由于TdR及其分解产物均为可溶性，而DN

50、A是不溶性的，因此，可通过一定的方法将它们与DNA分子分开。当将放射性核素标记的TdR引入待研究的实验体系后，放射性就会出现在被标记的细胞中。在细胞动力学研究中最多用的标记化合物为3H-TdR(或14C-TdR)，可采用离体或整体实验，由于体内实验存在射线辐射的影响，使用受到一定限制。放射自显影是最常用的方法之一(请参见有关章节)。二、示踪的具体方法 细胞动力学的示踪研究最主要的是对细胞进行标记。根据对细胞的标记时间、次数以及标记后的采样情况可将放射性核素标记法分为： (一)一次脉冲标记法：根据取材方法不同可分为一次取材和多次取材两种研究方法。 1.一次取材：采用的标记时间较DNA合成期短，将

51、3H-TdR加入含异步细胞群体的培养体系中培养1560分钟，以不含放射性的培养液洗涤数次，将样本作放射自显影，计数标记细胞并按下式计算标记指数(LI)：LI=Ns/Nc (65)Ns这标记细胞数，Nc为处于细胞周期中的总细胞数。由于稳定细胞群体中处于某一时相的细胞数量与该时相的时间成正比，因此，标记指数LI等于Ts(S期持续的时间)与Tc(一个细胞周期持续的时间)之比，即：LI=（Ts）/（Tc） (66)若已知Ts可求出Tc和To(细胞更新时间)。当GF生长分数=1时：Tc=Ts/LI=To对于按指数方式生长的细胞群体，根据下式计算Tc：Tc=（Ts）/（LI）loge2 (67) 2.多次

52、取材：进行一次脉冲标记后，在一定时间内多次取材，用自显影方法观察处于有丝分裂期的细胞(M细胞)中有3H标记的细胞的百分数，简称标记有丝分裂百分率(PLM)。 PLM=（标记有丝分裂细胞数）/（有丝分裂细胞总数）×100%以PLM为纵坐标，标记后时间为横坐标，可得PLM曲线见图6-2。上图6-2是细胞个体间无差异情况下的动力学过程的理想模型。当标记结束，原S期的细胞全部被标记，这些细胞进入M期后，即出现标记M期细胞，期间要经过G2期，由于开始一段时间内PLM等于零，故G2期为从标记开始至出现标记M期细胞的时间间隔。随着标记时间的延长，标记的S期细胞陆续进入M期，PLM逐渐上升并达到最高

53、值(100%)，此间隔即为TM期。当标记的S期细胞全部进入M期，而标记时处于G1期的非标记细胞亦开始进入M期时，PLM开始下降，这标志着所有的原S期细胞均通过M期，此间隔即为Ts期。随后PLM逐渐下降至零，直到S期细胞再次进入M期，PLM从零又逐渐上升。一个细胞周期时间即指PLM两次由零上升之间的间隔时间，因此，TG1=Tc-(TG2+Ts+TM) (68)应注意在实际工作中由于被标记细胞的同步化程度及取材时间间隔不同，以及各细胞周期时相的统计涨落的影响，实测的PLM曲线与理论的PLM曲线并非完全相同。如有时曲线的第二峰不能达到100%，计算细胞各参数时常采用曲线上50%的截点(见图6-2)。

54、因此，TG2期为从标记开始到标记M期细胞达50%的时间，实际上是TG2+TM/2，因TM为较短的时相，误差较小。Ts为曲线第一个波峰的两个50%之间的间隔；TC为第一个波峰和第二个波峰上升至50%两点间的时间；第一峰下降段的50%点与第二峰上升段的50%点间的时间间隔为TG1+TG2。此法不能求出TM，但若能精确测出TG2，可由TG2+TM/2计算TM。PLM法的局限性为不适用有丝分裂指数低的细胞组织，此外实验时需多次取材，工作量比较大。除PLM法外，也可采用银粒计数减半法(grain count halving method)研究细胞动力学。方法是：将3H-TdR脉冲标记后，在不同的时间间隔内多次取材制备自显影标本，计数标记核上的平均银粒数，平均银粒降低到原计数的一半所需的时间即为细胞周期时间。以本法进行细胞动力研究时要求细胞群体具有一定的同步化程度，故其应用受到较大限制。(二)二次脉冲标记法：对待测细胞群体用不同核素(如3H-TdR和14