第十一章紫外可见分析法

1、1药物分析教研室药物分析教研室主要内容2第一节第一节 基本原理和概念基本原理和概念第二节紫外可见分光光度计第二节紫外可见分光光度计第三节第三节 紫外可见分光光度分析方法紫外可见分光光度分析方法学习要求学习要求掌握掌握紫外吸收光谱的电子跃迁类型、吸收带的类型及影响因素；Lambert-Beer定律及其物理意义、适用条件、偏离因素；UV-Vis法用于单组分定量的方法；熟悉熟悉紫外-可见分光光度计的主要部件、工作原理和光路类型；了解了解紫外-可见分光光度法定性及纯度检查方法。3概述概述4紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法：基于物质分子对紫外：基于物质分子对紫外- -可可见光区（见光区（ 20

2、0-760 nm ）辐射的吸收的特性建立起）辐射的吸收的特性建立起来的一种来的一种定性、定量和结构分析定性、定量和结构分析的方法。的方法。特点：特点：灵敏度可达灵敏度可达10-4-10-6g/ml准确度准确度 0.2%-0.5%5 紫外可见光谱是由分子中紫外可见光谱是由分子中价电子价电子在不同的分子轨道在不同的分子轨道之间跃迁产生的。之间跃迁产生的。 一、电子跃迁类型一、电子跃迁类型第一节 基本原理和概念饱和单键的饱和单键的 电子电子不饱和双键的不饱和双键的 电子电子未成键的未成键的 n 电子（弧对电子）电子（弧对电子）轨道：轨道：电子围绕原子或分子运动的几率电子围绕原子或分子运动的几率 轨道

3、不同，电子所具有能量不同轨道不同，电子所具有能量不同6反键轨道反键轨道成键轨道成键轨道原子靠近而结合成分子时，原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道以线性两个原子的原子轨道以线性组合而生成两个分子轨道组合而生成两个分子轨道成键轨道：能量较低成键轨道：能量较低反键轨道：能量较高反键轨道：能量较高 orbital *orbital orbital * orbital n (p) electron跃迁类型：8按能量大小：按能量大小： * n * * n *93.电子跃迁类型电子跃迁类型（1） *跃迁：跃迁： 饱和烃（甲烷，乙烷）饱和烃（甲烷，乙烷） E很高，很高， n * * n * 跃迁类型

4、峰位 强弱 分子基团 举例150nm 弱弱 饱和烃类饱和烃类 CH3-CH3 ( ( max=135nmmax=135nm) )n* -200nm 较强较强 含含-OH, -NH2 CH3Cl-X,-S等等( max=215nm =140) * -200nm 强强 含不饱和键含不饱和键 CH2=CH2分子分子( max=165nm =10-4) n* 200-400nm 较弱较弱 含有杂原子含有杂原子 CH3COCH3不饱和基团不饱和基团( max=279nm =10-30)电子跃迁类型电子跃迁类型12max 104 10_100按能量大小：按能量大小： * n * * n * * n * *

5、 n *CH3CH3NH2OHC=CC=OC=SN=NE跃迁类型跃迁类型实例实例C=O131.1.吸收光谱（吸收曲线）：吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同，以不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同，以吸光度吸光度A A为纵坐标，波长为纵坐标，波长为横坐标作图得到的为横坐标作图得到的曲线曲线2.2.吸收光谱特征吸收光谱特征定性依据定性依据 吸收峰吸收峰maxmax 吸收谷吸收谷minmin 肩峰肩峰shsh 末端吸收末端吸收饱和饱和-* *跃跃迁产生强吸收不成峰迁产生强吸收不成峰143.生色团（发色团）生色团（发色团）:能吸收紫外能吸收紫外-可见光的基团可见光的基团 有

6、机化合物：有机化合物：具有不饱和键具有不饱和键(电子电子)和未成对电子和未成对电子(n 电子电子)的基团，产生的基团，产生n *跃迁和跃迁和 *跃迁跃迁例：例： CC；CO；CN；NN 注：注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强154助色团：是指含有非键电子的杂原子饱和基团助色团：是指含有非键电子的杂原子饱和基团，可以，可以使生色团吸使生色团吸 收峰加强，同时使吸收峰长移的基团收峰加

7、强，同时使吸收峰长移的基团 如：如： 连有杂原子的饱和基团连有杂原子的饱和基团例：例：OH，OR，NH，NR2，X5红移和蓝移：红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基） 或采用不同溶剂后或采用不同溶剂后 吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）16 6.增色效应和减色效应增色效应和减色效应 增色效应增色效应：吸收强度增强的效应：吸收强度增强的效应 减色效应减色效应：吸收强度减小的效应：吸收强度减小

8、的效应 7.强带和弱带：强带和弱带： max104 强带强带 max102 弱带弱带吸收带吸收带：吸收峰在紫外：吸收峰在紫外- -可见光谱中的位置可见光谱中的位置可分为：可分为：R R带、带、K K带、带、B B带、带、E E带、带、电荷转移吸收带、电荷转移吸收带、 配位体场吸收带配位体场吸收带171 1R R带：带：由由n n * *跃迁产生跃迁产生含杂原子的不饱和基团含杂原子的不饱和基团:C:CO O；C CN N；NNN N 弱吸收，弱吸收，maxmax100 ; 10104 4 共轭双键增加，吸收峰长移，强度增加。共轭双键增加，吸收峰长移，强度增加。193 3B B带：带：芳香族化合物

9、的主要特征吸收带芳香族化合物的主要特征吸收带 苯苯maxmax 256nm256nm，宽带，具有精细结构；，宽带，具有精细结构；maxmax=200=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失204 4E E带：带： 芳香族化合物的特征吸收带芳香族化合物的特征吸收带 E E1 1 180nm 180nm maxmax10104 4 （常观察不到）（常观察不到） E E2 2 200nm 200nm maxmax=7000=7000 强吸收强吸收 苯环被发色团取代且与苯环共轭时，苯环被发色团取代且与苯环共轭时，E E2 2带与带与K K带合并带

10、合并 一起红移（长移），被助色团取代一起红移（长移），被助色团取代E E2 2带带maxmax 和和都变大都变大211.1.位阻影响位阻影响 共轭效应，吸收带长移，吸光系数增加共轭效应，吸收带长移，吸光系数增加 发色团在同一平面，易形成共轭发色团在同一平面，易形成共轭 位阻影响分子的平面性位阻影响分子的平面性 max280nm(10500)max295.5nm(29000)顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯反式二苯乙烯反式二苯乙烯22232.2.跨环效应跨环效应 有有、不饱和醛酮结构，不饱和醛酮结构，适当的立体适当的立体排列使排列使R R带长移，吸收强度增强带长移，吸收强度增强 OCS243.3.溶剂效

11、应溶剂效应（1 1）对）对maxmax影响：影响： n -n -* *跃迁：溶剂极性跃迁：溶剂极性，maxmax蓝移蓝移 -* *跃迁：溶剂极性跃迁：溶剂极性，maxmax红移红移 （2 2）对吸收光谱精细结构影响）对吸收光谱精细结构影响 溶剂极性溶剂极性，苯环精细结构消失，苯环精细结构消失254.pH4.pH值的影响值的影响 影响物质存在型体，影响吸收波长影响物质存在型体，影响吸收波长max210.5nm,270nmmax235nm,287nmOH-H+-26透过率：T=It/I0，0T1吸光度：A=-lgT1 1、LambertLambert定律定律：AlAl（吸收层厚度）2 2、Beer

12、Beer定律定律：ACAC（吸收物质浓度） 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为：比耳定律，其数学表达式为： A=Ecl27描述物质对描述物质对单色光单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系的关系A A：吸光度：吸光度E E：吸光系数：吸光系数C C：溶液浓度：溶液浓度l l：光路长度：光路长度A=Ecl281、适用条件：、适用条件： 1) 单色光单色光 2) 稀溶液（稀溶液（10-2 10-5 M）2、吸收度的加和性、吸收度的加和性：a、b、c三种物质共存时3、该定律适用于固体、液体和气体样品、该定律适用于固体、液体和气体样品cbaAA

13、AA总294、吸光系数（E）：吸光物质在单位浓度及单位厚度时的 吸光度。根据浓度单位的不同，分为：（1）摩尔吸光系数）摩尔吸光系数 在一定下，c=1mol/L，l=1cm时的吸光度（2）百分吸光系数）百分吸光系数 在一定下，c=1g/100ml，l=1cm时的吸光度。（3）两者关系）两者关系1%1cmE1%110cmME301、吸光系数不随浓度和光程长度的改变而改变，、吸光系数不随浓度和光程长度的改变而改变， 仅仅与物质本身的性质有关与物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；，与待测物浓度无关；2、（、（1）不同物质，对同一不同物质，对同一，一般不同；（一般不同；（ ，吸光能力吸光能力 ） （2

14、）同一物质，对不同）同一物质，对不同，一般不同（一般不同（max）31 例：氯霉素（323.15），m a x=278 nm，C = 2.00mg/100ml T% = 24.3% ，l =，1 cm,求： , 30711000. 2614. 0lg3%11CLTEcm992010%11cmEM%11cmE32（一）（一） 化学因素化学因素Lambert-BeerLambert-Beer定律适用范围：稀溶液（定律适用范围：稀溶液（1010-2-2mol/Lmol/L）溶液中溶质可因浓度改变而有溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合离解、缔合与与溶剂间溶剂间的作用的作用等原因等原因, ,而发生偏离

15、而发生偏离BeerBeer定律的现象。定律的现象。 亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱(a) 6.3610-6 mol/L (b) 1.2710-4 mol/L (c) 5.9710-4 mol/L（一）（一） 化学因素化学因素Lambert-BeerLambert-Beer定律适用范围：稀溶液（定律适用范围：稀溶液（1010-2-2mol/Lmol/L）溶液中溶质可因浓度改变而有溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合离解、缔合与与溶剂间溶剂间的作用的作用等原因等原因, ,而发生偏离而发生偏离BeerBeer定律的现象。定律的现象。对此可控制溶液浓度、对此可控制溶液浓度、p

16、HpH等等条件而设法条件而设法减免减免。36（二）（二） 光学因素光学因素a. a. 非单色光非单色光 理论要求：平行单色光，理论要求：平行单色光， 实际：光源复合光实际：光源复合光 照射物质的光经单色器分光照射物质的光经单色器分光后后 并非真正单色光并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽其波长宽度由入射狭缝的宽度度 和棱镜或光栅的分辨率和棱镜或光栅的分辨率决定决定为了保证透过光对检测器的为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝响应，必须保证一定的狭缝宽度，这就使分离出来的光宽度，这就使分离出来的光具一定的具一定的 谱带宽度谱带宽度37b.b.杂散光的影响：杂散光的影响： 杂散光是指从

17、单色器分出的光不在入射光谱带宽杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值（二）（二） 光学因素光学因素38c.c.反射光和散射光的影响：反射光和散射光的影响： 反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光可使透射光减弱，可使透射光减弱， AA，一般可用空白对比校正，一般可用空白对比校正消除消除d d非平行光的影响：非平行光的影响： 使光程使光程，l l ，A

18、A（二）（二） 光学因素光学因素39（三）透光率的测量误差（三）透光率的测量误差TT1 1）暗噪音：）暗噪音：与检测器和放大电路等各与检测器和放大电路等各部件的不确切性有关，部件的不确切性有关，与光讯号无关与光讯号无关，可视为一，可视为一个常量。个常量。其在其在A为为0.20.7范围内，范围内，造成相对误差较小造成相对误差较小，为测量最适宜范围。为测量最适宜范围。 40 讯号噪音亦称讯号散粒噪音。光敏元件受光照射时的讯号噪音亦称讯号散粒噪音。光敏元件受光照射时的电子迁移，每一单位时间中电子迁移数量是不相等的，而电子迁移，每一单位时间中电子迁移数量是不相等的，而是在某一均值周围的随机数，形成测量

19、光强时的不确定性。是在某一均值周围的随机数，形成测量光强时的不确定性。随机数变动的幅度随光照增强而增大，与光的波长及光敏随机数变动的幅度随光照增强而增大，与光的波长及光敏元件的品质有关。元件的品质有关。 2 2）讯号噪音：）讯号噪音：与光讯号有关与光讯号有关（三）透光率的测量误差（三）透光率的测量误差TT4142431. 1. 光源光源 钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200400nm2单色器：单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件包括狭缝、准直镜、色散元件44 棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元

20、件 分出光波长不等距分出光波长不等距 光栅光栅衍射和干涉衍射和干涉 分出光波长等距分出光波长等距3吸收池吸收池： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不吸收紫外光，适用于紫外和可见不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）464检测器：检测器：将光信号转变为电信号的装置将光信号转变为电信号的装置5讯号处理与显示器讯号处理与显示器：讯号处理和显示系统讯号处理和显示系统光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器471 1单光束分光光度计：单光束分光光度计

21、：特点：使用时来回拉动吸收池 移动误差对光源要求高比色池配对( (一一) )几种光路类型几种光路类型482 2双光束分光光度计双光束分光光度计： 特点：特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱可以自动扫描吸收光谱 493 3双波长分光光度计双波长分光光度计 特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差504 4光多道二极管阵列检测分光光度计光多道二极管阵列检测分光光度计5152( (二二) )光学性能光学性能1.1.波长范围：波长范围：190-1100nm190-1100nm2.2.波长准确度：波长准确度

22、：仪器显示波长与实际波长之差仪器显示波长与实际波长之差0.3nm0.3nm3.3.波长重现性：波长重现性：0.2nm0.2nm4.4.透光率范围：透光率范围：0-300%0-300%5.5.吸光度测量范围：吸光度测量范围：-0.447-0.447+3.00+3.006.6.光度准确度：光度准确度：0.3%0.3%7.7.光度重复性：光度重复性：0.3%0.3%8.8.分辨率：分辨率：单色器分辨两条靠近的谱线的能力单色器分辨两条靠近的谱线的能力.260nm.260nm， =0.3nm9.9.杂散光杂散光：220nm220nm处（处（1%NaI1%NaI）0.1%0.1%53( (三三) )仪器的

23、校正仪器的校正1.1.波长的校正波长的校正氢灯或氘中的较强谱线氢灯或氘中的较强谱线486.13nm(F486.13nm(F线线) )和和656.28nm656.28nm（C C线）线）稀土玻璃（镨钕、钬）、某些元素（汞、钾、铯）苯稀土玻璃（镨钕、钬）、某些元素（汞、钾、铯）苯蒸汽检查和校正波长读数。蒸汽检查和校正波长读数。542.2.吸光度的校正吸光度的校正60mg60mg重铬酸钾用重铬酸钾用0.005mol/L0.005mol/L的硫酸溶液稀释至的硫酸溶液稀释至1000ml1000ml，在，在规定波长处测定并计算吸收系数，与规定值比较。规定波长处测定并计算吸收系数，与规定值比较。规定值：规定

24、值：235nm 123.0235nm 123.0126.0126.0 257nm 142.8 257nm 142.8146.2146.2 313nm 47.0 313nm 47.050.350.3 350nm 105.5 350nm 105.5108.5108.53.3.吸收池校正吸收池校正 两吸收池测定的差值小于两吸收池测定的差值小于1%1%55定性鉴别定性鉴别纯度检查和杂质限量测定纯度检查和杂质限量测定 单组分的定量方法单组分的定量方法多组分的定量方法多组分的定量方法56（一）单组分的定量方法（一）单组分的定量方法 1 1吸光系数法吸光系数法 2 2标准曲线法标准曲线法 3 3对照法：外标

25、一点法对照法：外标一点法AEc l定量依据：注意注意: : 1 1）选择吸收光谱中的吸收峰对应的波长）选择吸收光谱中的吸收峰对应的波长 2 2）多个吸收峰，选择无干扰的、较高的峰）多个吸收峰，选择无干扰的、较高的峰 3 3）测定波长大于溶剂的截止波长）测定波长大于溶剂的截止波长57 /100Ac gmLE l/ Ac mol Ll或1 1吸光系数法（绝对法）吸光系数法（绝对法）例：例：维生素维生素B B1212 的水溶液在的水溶液在361nm361nm处的百分吸光系数为处的百分吸光系数为207207，用，用1cm1cm比色池测得某维生素比色池测得某维生素B B1212溶液的吸光度溶液的吸光度是

26、是0.4140.414，求该溶液的浓度，求该溶液的浓度? ?0.4140.00200(/100)207 1AcgmLE l解：解：例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？ 已知361nm处的百分吸光系数为207解：%0 .98%100251000101001001045. 2%512Bg/ml102.45g/100ml1045. 21207507. 05-3iC592标准曲线法标准曲线法配制一系列浓度不同配制一系列浓度不同的标准溶

27、液，在一定波的标准溶液，在一定波长下分别测定吸光度长下分别测定吸光度A。以以A为纵坐标，浓度为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制为横坐标，绘制A-c标标准曲线。准曲线。并从标准曲线上找出并从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或对应的被测溶液浓度或含量。含量。00.10.20.30.40.50.60.70.8024681012Concentration (ug/mL)AbsBlank Standard SampleSample60示例芦丁含量测定61相同条件下配制样品溶液和标准溶液，在同一相同条件下配制样品溶液和标准溶液，在同一波长处测二者吸光度波长处测二者吸光度cAcAccAA样样标样样标标标例：例：精密吸取精密吸取B B1212注射液注射液2.50mL2.50mL，加水稀释至，加水稀释至10.00mL10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品另配制对照液，精密称定对照品25.00mg 25.00mg ，加水稀释至，加水稀释至1000mL1000mL。在。在361nm361nm处，用处，用1cm1cm吸收池，分别测定吸光度为吸收池，分别测定吸光度为0.5080.508和和0.5180.518，求，求B B1212