蛋白质组学研究介绍结合双向电泳ppt课件

1、 蛋白质组学引见蛋白质组学引见 结合结合BIO-RAD相关仪器相关仪器One Genome Many Proteomes对生物的生化功能,构成途径与代谢过程之研讨而更加了解 Normal geneexpression基因体功能的最终目的就是表现蛋白质;基因表现及调控(Gene expression and regulation)的过程,那么是为了保证蛋白质能适时,适地并适量的表现 中心法那么中心法那么 蛋白质组学(proteomics)，就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达程度与修饰形状，了解蛋白质之间的相互作用与联络，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研讨领域。

2、蛋白质组学与基因组学的关系：1、蛋白质组与基因组相对应2、基因组是相对稳定的，而蛋白质组是一个动态的概念3、蛋白质组是基因组研讨不可短少的后续部分蛋白质组学蛋白质组学 蛋白质组学的研讨可以协助我们去寻觅新的疾病目的蛋白质组学的研讨可以协助我们去寻觅新的疾病目的, ,置信在不久的未置信在不久的未来将有助于监测疾病的进程来将有助于监测疾病的进程, ,更进一步有助于疾病的治疗。更进一步有助于疾病的治疗。1-1 1-1 心血管疾病研讨领域心血管疾病研讨领域 扩展性心肌病变扩展性心肌病变(Dilated cardiomyopathy, DCM )(Dilated cardiomyopathy, DCM

3、)是一种严重的心脏疾是一种严重的心脏疾病病, ,也是现代忙碌的都市人经常易患的疾病也是现代忙碌的都市人经常易患的疾病, ,最后将导致心脏失去功能最后将导致心脏失去功能; ;病人病人通常都只能等待换心以维持生命。通常都只能等待换心以维持生命。 运用蛋白质体的方法曾经鉴定出心肌中运用蛋白质体的方法曾经鉴定出心肌中150150种蛋白质种蛋白质, ,比较后发现有比较后发现有2525个个蛋白质有明显的差别蛋白质有明显的差别; ;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人经由这些已确认的蛋白质资料库与病人( (或高危险群或高危险群) )的蛋白质做比对的蛋白质做比对, ,或答应以在疾病产生初期到达早期预防的目的或答

4、应以在疾病产生初期到达早期预防的目的. . 一、疾病诊断一、疾病诊断蛋白质组学运用蛋白质组学运用1-2肿瘤研讨领域肿瘤研讨领域1-2-1肺癌肺癌 肺癌是最具肿瘤性肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一的疾病之一.临床上肺癌的诊断往往临床上肺癌的诊断往往已属晚期已属晚期.直至目前为止直至目前为止,并无有效的治疗方案可得并无有效的治疗方案可得.所以任何有助于肺癌诊断所以任何有助于肺癌诊断或预后的开展都是有助于肺癌的治疗方针的。或预后的开展都是有助于肺癌的治疗方针的。 因此因此,许多科学家努力于以双向电泳技术研讨肺癌许多科学家努力于以双向电泳技术研讨肺癌.在分析组织病理学上不在分析

5、组织病理学上不同种类的肺癌细胞时同种类的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞领会有不同的蛋白质表结果发现不同组织病理类型细胞领会有不同的蛋白质表现图谱。现图谱。 另外另外,已发现有一种专注性的蛋白质仅会出如今原发性肺腺癌上已发现有一种专注性的蛋白质仅会出如今原发性肺腺癌上.例用此技术例用此技术将可有效地鉴定出新的肿瘤标志将可有效地鉴定出新的肿瘤标志 (tumor marker),在鉴别诊断麟状上皮细胞肺在鉴别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益。癌与腺癌时有相当大的助益。蛋白质组学运用蛋白质组学运用 人类的肾脏癌是很难治愈的癌症人类的肾脏癌是很难治愈的癌症, ,其中源自于近端肾小管上

6、皮细胞的肾细胞其中源自于近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌大约占成人恶性肿瘤的癌大约占成人恶性肿瘤的3 %.3 %.但好像许多本质性肿瘤般但好像许多本质性肿瘤般, ,肾细胞癌发现时期均属癌症末肾细胞癌发现时期均属癌症末期期, ,外科手术已难治愈的阶段外科手术已难治愈的阶段. .并且无适当的肿瘤标志可参考。并且无适当的肿瘤标志可参考。 科学家在用双向电泳技术研讨肾脏癌组织的研讨中发现有四种蛋白质的表如今肾癌科学家在用双向电泳技术研讨肾脏癌组织的研讨中发现有四种蛋白质的表如今肾癌细胞中会消逝细胞中会消逝. . 虽然该研讨没有发现特定的标志蛋白质，但尚有许多能够与该癌症发生相关的蛋白虽然该研讨没有发现特定

7、的标志蛋白质，但尚有许多能够与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鉴定质仍待被鉴定. .1-2-2肾脏癌肾脏癌 蛋白质组学运用蛋白质组学运用蛋白质组学运用蛋白质组学运用1-2-3结肠癌结肠癌 结肠癌是一种常见的癌症结肠癌是一种常见的癌症.利用双向电泳与免疫转印技利用双向电泳与免疫转印技术术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分别出的一系分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分别出的一系列蛋白质列蛋白质.并将有意义之蛋白质点切割出并将有意义之蛋白质点切割出,进展蛋白质序列进展蛋白质序列分析以鉴定这些蛋白质。分析以鉴定这些蛋白质。 结果发现结果发现 hsp 70 酸性的酸性的 isoforms 在结肠息肉在结

8、肠息肉 (polypous) 与恶性组织与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论中的表现不论是在量上或质上均有相当的差别是在量上或质上均有相当的差别;此外在慢性发炎性肠炎此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或的黏膜或 Crohns 肠炎组织中那么有不同的肠炎组织中那么有不同的 hsp 70 碱性碱性 isoform 被发现。被发现。蛋白质组学运用蛋白质组学运用1-3神经精神系统疾病研讨领域神经精神系统疾病研讨领域 对精神分裂症患者以及正常人群的脑脊液进展蛋白质组学对精神分裂症患者以及正常人群的脑脊液进展蛋白质组学的研讨。对老年痴呆症的研讨。对老年痴呆症(lzhermer 症症)的

9、研讨：经过对神经原的研讨：经过对神经原缠结的缠结的2DE及质谱分析那么发现及质谱分析那么发现,其主要蛋白质成份其主要蛋白质成份-微管相关微管相关蛋白蛋白(MAP)在疾病形状下发生了磷酸化、糖基化等多种修饰在疾病形状下发生了磷酸化、糖基化等多种修饰作用。作用。二、病原微生物的蛋白质组学研讨二、病原微生物的蛋白质组学研讨1、确定致病菌毒力、确定致病菌毒力;2、寻觅新的诊断标志物、寻觅新的诊断标志物;3、为疫苗的研制寻觅新的候选抗原、为疫苗的研制寻觅新的候选抗原;4、阐明药物抗菌作用机制与病菌耐药性发活力理、阐明药物抗菌作用机制与病菌耐药性发活力理,为为新的抗生新的抗生素的研制寻觅靶点。素的研制寻觅

10、靶点。蛋白质组学运用蛋白质组学运用三、蛋白质组学在药物开发中的运用 疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点,另外经过翻译后修饰的蛋白质组学研讨,使得新药研制获得了前所未有的契机。以DSPs为靶点,分析其分子构造,定向合成有效药物成为药物设计的理想方式。蛋白质组学运用蛋白质组学运用蛋白质组学研讨流程蛋白质组学研讨流程Condition ACondition B34710pH+-+SAMPLE PREPARATIONFIRST DIMENSIONSECONDDIMENSIONSTAININGIMAGINGANALYSIS &EXTRACTIONMASS SPECTROMETRI

11、CIDENTIFICATION OF SPOTS2-D Expression Proteomics Methodology 根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器二、样品定量RC DC Protein Assay 蛋白定量试剂盒蛋白定量试剂盒根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器三、双向电泳第一向Protean i12IEF等电聚焦仪主要特点主要特点每个泳道可独立控制 这意味着：不同的样品不同的方法不同的pH梯度 Bio-Rad 是独一可以提供独立泳道控制的IEF系统价值所在价值所在每个泳道独立控制优点：节省时间减少优化实验条

12、件需求的运转次数同时可运转多个实验优点：保证实验质量个别不良样品不会使整个实验失败更好的反复性缘由?可对每个泳道设定最大电流传统的IEF是对一切泳道设定一个总的最大电流假好像一次运转过程中样品的导电性能差别较大，可呵斥电流在各个泳道内分布不均PROTEAN i12 IEF : 为每一泳道设定独立的电流限制，防止了样品间的相互影响，提高实验重现性和一致性。节省时间保证实验质量PROTEAN i12 IEF Cell传统传统IEF：每个泳道的电流都遭到其他泳道内样品影响都遭：每个泳道的电流都遭到其他泳道内样品影响都遭到其他泳道内样品影响到其他泳道内样品影响60A140A100A100A传统 IEF

13、PROTEAN i12 IEF等电聚焦原理等电聚焦原理: 在第一向分别中蛋白质先按其等电点不同分开isoelectric point pI值。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分别的技术称为等电聚焦。 +pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 101-D ElectrophoresisThe 1st D: Isoelectric FocusingReadyPrep IPG Strips根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器四、双向电泳第二向SDS-PA

14、GESDS-PAGE+pH 3pH 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesizeThe 2nd D: SDS-PAGEProteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distancepIM.Wt.2-D Electrophoresis根据实验流程引见相关仪器根据实验流程引见相关仪器五、染色GS-800DensitometerPDQuestImage analysis六、图像的采集及分析六、图像的采集及分析PDQuest分析流程：PDQuestIntuitive Spot Detection WizardExcision / digestion七、切胶七、切胶质谱前处置质谱前处置差别蛋白点的切取差别蛋白点的切取脱色脱色胶内酶解胶内酶解肽片断提取肽片断提取点样点样质谱分析质谱分析数据库比对进展鉴定数据库比对进展鉴定手工切胶的缺陷：手工切胶的缺陷：低丰度蛋白无法准确切取低丰度蛋白无法准确切取非密闭系统非密闭系统,污染无法防止污染无法防止角蛋白污染角蛋白污染其它杂质污染其它杂质污染任务时间长任务时间长全自动蛋白切取仪可切取的范围广泛，速度快，精度高，防止污染。Mass spectrometry50