聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子

1、实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白【目的和要求】通过本实验学习垂直板电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作。【基本原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylaminde gel electrophoresis， PAGE）可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲 液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。如果在聚丙烯酰胺胶不连续系统，碱性缓冲体系中，分离血清蛋白质，由于具有浓缩、电荷、分子筛三种效应，所以分离效果好，分辨率高，血

2、清用纸电泳只能分出57个成分，用聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳可分出30多个条带清晰的成分。【操作方法】1凝胶的制备（1）不连续系统状凝的制备步骤装板：方法a：凝胶模子由3部分组成：一个压制成“ ”形的硅橡胶带；两块长短不等玻璃板；样品槽模板。胶带的内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃板嵌入槽内。玻璃板之间形成一个0.52mm厚的间隙，待制胶时，将玻璃板洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。将长玻璃板下沿与胶带框底之间保持12距离，使此端的凝胶与一侧的电极槽相通，而短玻璃板的下测则插入橡胶框的底槽内，由此便形成一个“夹心”凝胶腔。把上述好的凝胶腔置于电泳槽内，用长螺丝将两个半槽固定在一起。在拧紧螺丝时，要按

3、照一定的顺序逐个拧紧，均匀用力，不能用力过猛或先拧紧一个后再拧另一个，否则电泳槽受力不均会使玻璃板压碎，电泳槽损坏，造成漏胶、渗液等现象。方法b： 灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶事凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持的一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻玻璃片应面对一定顺逐个序拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直旋置，在长玻璃片下端与硅胶枢交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1%琼脂、溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。配胶：将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳

4、装置，垂直放置在水平台面上，准备灌注胶液。根据所测蛋白质相对分子质量范围，选择某一合适的分离胶浓度，按照表1所列的试剂用量和加样顺序配制某一合适的凝胶。凝胶液灌注和聚合：灌注凝胶液前先用滴管吸取少量的用电极缓冲液配制的1.5%琼脂（1%玉脂糖）溶液，灌入凝胶模板底部（长玻璃板处侧，下沿凹形小槽内），其液面高度约为0.51.0cm（注意：要使琼脂液面平整）。待琼脂凝固后，堵住凝胶模下面的窄缝（通过电时又可作为盐桥）。将所配制的凝胶液沿着凝胶腔的长玻璃板的内缓缓倒入或用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿23cm处为止。凝胶液的注入和聚合i.分离胶胶液的注入和聚合方法是：用一注射器

5、通过注射针头沿玻璃管内壁缓慢注入0.51cm高度的蒸馏水（或正丁醇）进行水封。水封的目的是隔绝空气中的氧，并有消除凝胶柱表面弯月面，使凝胶柱顶部的表面平坦。水封切忌注入蒸馏水时呈滴状垂直下落，否则会使用顶部的凝胶浓度变稀，从而改变预定的凝胶孔径，并造成凝胶表面不平坦。水层封好后，静置凝胶液进行聚合反应，聚合时温度要与电泳时温度相同。正常情况下10min开始聚合，应控制在40min左右聚合完成。刚加水时有界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表面凝胶已经聚合，再静置30min使聚合完成 。ii.浓缩胶胶液的注入和聚合方法是：用注射器或滴管吸去分离胶胶面顶端的水封层，并用无毛边的滤纸条吸去残留的水液

6、，滤纸尽量不要接触分离胶的胶面。按比例混合浓缩胶（表1），混合均匀后用滴管将凝胶加到分离胶上方，当浓缩胶液面距短玻璃板上缘0.2时，把梳形样品槽模板轻轻地插入胶液顶部。静置聚合，待出现明显界面表示聚合完成。插入样品槽模板目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽。电泳前，将样品液分别加在这些凹槽中。浓缩胶也可用光聚合法，即不用Ap液，代之加入11.5mL的4%核黄素溶液（4mg核黄素溶于水中，加水到100mL）。浓缩胶如用核黄素催化，应在距管10cm处用日光灯照，进行光聚合。注意不要使温度上升过高。在正常情况下，照射67min就可看到浓缩胶呈乳白色，表明聚合开始，继续照射半小时，使聚

7、合完全。表1 不连续系统不同浓度凝胶配制用量表分离胶浓度试剂名称配制15mL不同浓度的分离胶所需试剂量（mL）配制5mL 4%浓缩胶（mL）7.5%10%12%15%20%分离胶308%胶母液3.7567.510Tris-HCI(pH8.9)1.81.81.81.81.8浓缩胶308%胶母液0.7Tris-HCI(pH6.7)0.6310%TEMED蒸馏水0.159.20.157.80.156.80.155.30.152.80.053.4以上储备液加入后混匀，为了去除抑制凝胶聚合的氧，AP加入之前进行抽气处理，本实验将此步省略并不影响实验结果10%过硫酸铵（AP）0.20.20.20.20.2

8、0.052.蛋白质样样品的处理取10L血清（2g/L），加5L 40%蔗糖、5L 0.1%溴酚蓝指示剂，混匀。3加样聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法：在垂直型电泳装置（参见图5）的两个“半槽”，即电极上槽和下槽内，分别加电极缓冲液，电极上槽，即铂金丝在上方的“半槽”内加的缓冲液必须高于铂金丝。用微量注射依次在各个样品槽内加样，各加1015L（含蛋白质1015g），稀溶液可加2030L（还要根据凝胶厚度及蛋白质浓度灵活掌握）。4电泳上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪（仔细观察正负极的变化）。对于垂直板型电泳，开始时电流控制在12mA/样品孔，太高的电流强度会造成产热量大，使分离失效。如果高温

9、对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效的冷却。对于垂直板型电泳，一般样品进入浓缩胶前电流控制在1520mA，持续大约3060min；待样品进入分离胶后，将电流调到2030mA，保持是电流强度不变。待指示染料迁移至下沿约0.51处停止电泳，需34h。5染色电泳结合后，将两块玻璃板剥开，将胶取出入入平皿中，加入固定液固定30min。然后弃去固定液，加入染色液，染色10min。6脱色染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。一天换23次脱色液，直至凝的蓝黑钯背景褪去、蛋白质带清晰为止。脱色时间一般约需一昼夜（注意：与上述两种染色液相对应，也有两种脱色液）。7绘画【注意事项】1凝胶浓度的选择根据所分离蛋

10、白质的相对分子质量范围选择最适凝胶浓度，5%的凝胶最适于分离蛋白质的相对分子质量范围是25000200000，10%的凝胶最适于分离蛋白质的相对分子质量范围是1000070000，3.33%的凝胶可用于分离相对分子质量更高的蛋白质。2凝胶聚合过程中过硫酸铵的作用在凝胶的催化聚合过程中，凝胶的聚合作用通常是使用通常是使用能提供自由基（free radicals）的一些催化氧化-还原体系（catalyst-redox systems）来完成的。例如，过硫酸铵-四甲基乙二胺（TEMED）、核黄素-TEMED、过硫酸铵-3-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。本实验采用的体系是过硫酸铵-四甲基乙二胺，以它为

11、例，化学聚合的作用是这样进行的：由于TEMED在碱基催化过硫酸铵，使其形成自由氧基。当（NH4）2S2O8（过硫酸铵）溶解于水中时，形成自由基（S2O82-2SO4-），这些自由基与丙稀酰接触，激活单体（丙烯酰胺）而形成单体长链。与此同时，由于交联剂Bis的存在，使长链与长链彼此交联形成凝胶。由于过硫酸铵（AP）在凝胶的聚合过程中起着重要的作用，所以在配制AP时应注意以下几个问题：（1）最好用近期生产的过硫酸铵，否则可先将表面一层去掉，尽量取下层称量，以防被氧化失效。（2）当放入水中时，要听到有轻微的拍拍响气。（3）临用前配制，盛于棕色瓶中，并存放在冰箱里，使用期不超过一星期。【材料与试剂】1

12、实验材料：动物血清2实验试剂（1）30.8%胶母液：称取30g丙稀酰胺、0.8gN,N-甲叉双丙稀酰胺，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL。过滤，4保存。（2）pH8.9分离胶缓冲液：取36.6g Tris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至8.9（约48ml）后，定容至100mL。（3）pH6.7浓缩胶缓冲液：取6.0g Tris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至6.7（约48mL）后，定容至100mL。（4）1%（W/V）TEMED溶液：取1mL TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），加蒸馏水稀释至100mL，置棕色瓶中，4保存。（5）10%（W/V）过硫酸

13、铵溶液：称取过硫酸铵（NH4）2S2O8（简称AP）lg，溶于10mL蒸馏水中。临用前配制。（6）电泳缓冲液（pH8.3）：取Tris 6g，甘氨酸28.8g，溶解，用蒸馏水稀释至1L。用时稀释10倍。（7）40%蔗糖溶液（8）0.1%溴酚蓝指示剂（9）固定液：454mL 50%甲醇水溶液和46mL冰乙酸。（10）氨基黑10B染色液：取1g氨基黑10B染料，用7%（V/V）乙酸溶解，稀释至1L。（11）脱色液：·酸-甲醇-水脱色液：取冰乙酸75mL，甲醇50mL，加蒸馏水875mL。·7%（V/V）乙酸脱色液：取冰乙酸35mL,加蒸馏水465mL。【实验器材】垂直板型电泳槽

14、电泳仪（电压300600V，电流50100mA）微量注射器（50L或100L）白瓷盘【思考题】140%蔗糖和0.1%溴酚蓝的作用是什么？2本实验是否需在低温下进行？3电泳过程中正负极发生什么变化？4产生实验误差的原因可能是什么？根据你的实验进行分析。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核糖核酸【目的和要求】掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及使用范围和操作技术，包括制胶、灌胶、加样、剥胶及染色等。【基本原理】 随着蛋白质分离技术的发展，人们已将聚丙烯酰胺凝胶电泳引用到核酸研究上。使用2.5的聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以依次将4s tRNA、5sRNA、mRNA及16、18、23、26s的rRNA分开。电泳分离后，再

15、用次甲基蓝染色。由于4s的tRNA及5sRNA分子量较小，当电泳时间太长或胶条太短时，很易泳出胶条之外，如果需要对它们专门研究，应换用5的聚丙烯酰胺凝胶。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等一般可采用胶中孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 【操作方法】1、聚丙烯酰胺凝胶制备 （l）装板：先将玻璃板和1mm垫条彻底洗净、晾干 长玻璃和短玻璃之间两测放入1mm垫条，把长玻璃和短玻璃及垫条对齐，用透明胶带密封两测及底边。 （2）配胶（2.4） 若胶太软，不易操作，可加入0.5琼脂糖。：凝胶灌注和聚合 取 4ml 制胶贮存液（15丙烯酰胺-7.5双丙烯酰胺混合液 试剂1），12.27ml水及 8

16、.33ml 3E缓冲液（试剂2）混匀，放在真空于操器中抽去制胶贮存液中的空气，待液体沸腾30秒后，取出，加入 0.2ml10TEMED溶液和 0.2ml 10过硫酸铵溶液，再混匀。立即将此液灌到已封闭的玻璃板间,使玻璃板与平面成 45°角放置,后再小心地加上 3-5mm 高度的水层覆盖在胶的表面。自加入过硫酸铵起，到水封为止，全部操作应不超过 20min。室温下任其自然聚合，当天使用。该胶板也可在室温下放置过夜后使用。 制备5胶的步骤，除去应取 8.33ml 制胶贮存液, 7.94ml水及 8.33ml 3E及缓冲液外，以下各步皆同上，只是因5胶更易聚合,所以动作应更迅速。5胶柱应于

17、当日制作，当日使用（tRNA于此胶中每小时泳动2cm）。 2、加样：用滤纸条吸去胶柱上面的覆盖水层，将胶板的透明胶带取下,固定于电泳槽中，向槽中灌入电极缓冲液（试剂3）。 取10µL样品溶液，再加入 2µL 0.2g/L的溴酚蓝指示剂，混匀后，用微量注射器将含有指示剂的样品蔗糖溶液小心地转移，加到胶板顶端的加样槽中。取已知的样品作为标准，与未知样品一起泳动，用以帮助鉴定未知样品分子量大小。 3、电泳：样品加入后，上槽接负极，下槽接正极，打开电流仪进电泳。 电泳条件：10一15V/cm，本实验所需电压为60-100V。溴酚蓝指示剂区带移动到距胶板下端约l厘米处，停止电泳。 4

18、、染色与固定：电泳结束后，将两块玻璃板剥开，小心将胶取出放入培养皿，加入10ml 1M醋酸固定20min，再放入次甲基蓝染色液内染色4h左右。然后在蒸馏水中浸泡脱色，不断地更换蒸馏水，直至胶板背景洗净，然后将胶板浸在7醋酸中固定。 5、测量、绘画。【材料与试剂】（1）制胶贮存液(15丙烯酰胺-7.5双丙烯酰胺混合液)：称取7.5g丙烯酰胺，0.375g 双丙烯酰胺溶于50ml水中。（2）3E 缓外液(0.12M Tris-0.06M 醋酸钠-0.003M EDTA，pH7.4 缓冲液)。 称取14.54g Tris, 8.2g 醋酸钠，1.1g EDTA溶于水中，用冰醋酸调至pH7.4，稀释到1000ml。（3）聚丙烯酰胺电泳电极缓冲液(O.004M Tris-0.02M 醋酸钠-O