高效液相色谱法测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷的含量

1、高效液相色谱法测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷的含量                     作者：李国军，毛晓霞，苏占辉，刘玉翠，陈四平 【摘要】   目的测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷的含量。方法高效液相色谱法。结果野黄芩苷进样量在0.914.55 g范围内，峰面积积分值与进样量有良好的线性关系，r=0.999 9，平均加样回收率为99.23%，RSD=2.21%。结论该法可以

2、用于该药的质量控制。 【关键词】   注射用黄芩茎叶总黄酮 野黄芩苷 高效液相色谱法    黄芩茎叶为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分,其有效部位为黄芩茎叶总黄酮（total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi, SSF），其化学成分主要包括野黄芩苷、黄芩苷、芹菜素苷、白杨素-7-O-D-葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物。其中野黄芩苷具有清热解毒、扩张血管、改善体内微循环等明显药理活性1。药 理学 研究发现黄

3、芩茎叶总黄酮具有较强的抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂和较强的记忆改善作用24。为了有效地发挥黄芩茎叶的药用价值，方便急诊及不能口服药物的病人，我们将黄芩茎叶有效成分精制纯化，研制了注射用黄芩茎叶总黄酮。本实验通过建立HPLC法测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷含量的方法来控制制剂的内在质量。 1  仪器与试药 1.1  仪器Shimadzu10ATvp高效液相色谱仪，CLASSvp5.0色谱数据工作站，瑞士产梅特AG-245型 电子 分析天平，惠普HP-8453紫外可见分光光度计，KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1.2  试药野黄芩苷对照品（

4、 中国 药品生物制品检定所，批号110842-200504），注射用黄芩茎叶总黄酮（承德医学院中药研究所研制）。 2   方法与结果 2.1   色谱条件色谱柱为Discovery C18(4.6 mm×250 mm, 5 m)；流动相为以甲醇-0.1%甲酸溶液进行梯度洗脱，030 min由40%的甲醇的0.1%甲酸溶液增加到70%甲醇的0.1%甲酸溶液；流速0.8 ml/min；检测波长335 nm；柱温26；进样量10 l。2.2   检测波长的选择将野黄芩苷对照品溶液进行光谱扫描，结果最大吸收波长为335 nm，故选择

5、335 nm为检测波长。2.3   对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h的野黄芩苷对照品22.75 mg至50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(0.455 mg/ml)，备用。精密吸取上述溶液5 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液(0.227 5 mg/ml)。2.4   供试品溶液的制备 取黄芩茎叶总黄酮冻干粉10 mg,精密称定，置10 ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min使溶解，放冷，补加甲醇至刻度，摇匀，放置，取上清液用微孔滤膜（0.45 m）滤过，取续滤液，作

6、为供试品溶液。2.5   空白试验按照样品制备工艺，制成不含黄芩茎叶总黄酮成分的空白冻干粉针，作为阴性对照，同法测定。结果空白冻干粉在与野黄芩苷对照品相同保留时间处无色谱峰，故认为无干扰。2.6   线性关系考察精密吸取浓度为0.455 mg/ml的野黄芩苷对照品储备液2，4，6，8，10 l依次注入色谱仪中，在前述色谱条件下，测定野黄芩苷的峰面积，结果见表1。以进样量X（g）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，见图1。回归处理得直线方程为Y=5×106X-351 032，r=0.999 9。表1  线性关系测定结果（略）x

7、    【摘要】   目的测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷的含量。方法高效液相色谱法。结果野黄芩苷进样量在0.914.55 g范围内，峰面积积分值与进样量有良好的线性关系，r=0.999 9，平均加样回收率为99.23%，RSD=2.21%。结论该法可以用于该药的质量控制。 【关键词】   注射用黄芩茎叶总黄酮 野黄芩苷 高效液相色谱法    黄芩茎叶为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分,其有效部位为黄芩茎叶总黄酮（total flavonoids

8、from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi, SSF），其化学成分主要包括野黄芩苷、黄芩苷、芹菜素苷、白杨素-7-O-D-葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物。其中野黄芩苷具有清热解毒、扩张血管、改善体内微循环等明显药理活性1。药 理学 研究发现黄芩茎叶总黄酮具有较强的抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂和较强的记忆改善作用24。为了有效地发挥黄芩茎叶的药用价值，方便急诊及不能口服药物的病人，我们将黄芩茎叶有效成分精制纯化，研制了注射用黄芩茎叶总黄酮。本实验通过建立HPLC法测定注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷含量的方法来控制制剂的内在质量。 1

9、  仪器与试药 1.1  仪器Shimadzu10ATvp高效液相色谱仪，CLASSvp5.0色谱数据工作站，瑞士产梅特AG-245型 电子 分析天平，惠普HP-8453紫外可见分光光度计，KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1.2  试药野黄芩苷对照品（ 中国 药品生物制品检定所，批号110842-200504），注射用黄芩茎叶总黄酮（承德医学院中药研究所研制）。 2   方法与结果 2.1   色谱条件色谱柱为Discovery C18(4.6 mm×250 mm, 5 m)；流动相为以甲醇

10、-0.1%甲酸溶液进行梯度洗脱，030 min由40%的甲醇的0.1%甲酸溶液增加到70%甲醇的0.1%甲酸溶液；流速0.8 ml/min；检测波长335 nm；柱温26；进样量10 l。2.2   检测波长的选择将野黄芩苷对照品溶液进行光谱扫描，结果最大吸收波长为335 nm，故选择335 nm为检测波长。2.3   对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h的野黄芩苷对照品22.75 mg至50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(0.455 mg/ml)，备用。精密吸取上述溶液5 ml至10 ml量瓶中，加甲

11、醇稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液(0.227 5 mg/ml)。2.4   供试品溶液的制备 取黄芩茎叶总黄酮冻干粉10 mg,精密称定，置10 ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min使溶解，放冷，补加甲醇至刻度，摇匀，放置，取上清液用微孔滤膜（0.45 m）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。2.5   空白试验按照样品制备工艺，制成不含黄芩茎叶总黄酮成分的空白冻干粉针，作为阴性对照，同法测定。结果空白冻干粉在与野黄芩苷对照品相同保留时间处无色谱峰，故认为无干扰。2.6   线性关系考察精密吸取浓度为0.455 mg/ml的野黄

12、芩苷对照品储备液2，4，6，8，10 l依次注入色谱仪中，在前述色谱条件下，测定野黄芩苷的峰面积，结果见表1。以进样量X（g）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，见图1。回归处理得直线方程为Y=5×106X-351 032，r=0.999 9。表1  线性关系测定结果（略）结果表明野黄芩苷进样量在0.914.55 g范围内，峰面积积分值与进样量有良好的线性关系。2.7   精密度实验精密吸取野黄芩苷对照品溶液（0.227 5 mg/ml）10l，连续进样6次，记录对照品峰面积依次为10 527 733，10 519 059，10 419 713

13、，10 553 602，10 523 716，10 630 278，测定结果RSD为0.64%, 表明精密度良好。2.8   稳定性实验精密吸取同一供试品溶液10 l，于制样后0，2，4，8，24 h连续进样测定，峰面积分别为10 589 059，10 823 828，10 499 713，10 533 653，10 714 625，测定结果RSD为1.27%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。2.9   重复性实验取同批样品（批号080718）5份，按样品含量测定项下依法平等操作，测定每份样品中野黄芩苷含量分别为0.221, 0.214, 0.

14、219, 0.229, 0.218 mg/mg，测定结果RSD为2.52%。2.10   加样回收率实验取6份已知野黄芩苷含量的供试品5 mg(批号080718，平均含量为0.220 mg/mg)，精密称定，各精密加入野黄芩苷储备液（0.455 mg/ml）3 ml，按供试品溶液制法制备，依法测定， 计算 加样回收率，结果平均回收率为99.23%，RSD为2.21%。结果见表2。表2  野黄芩苷回收率实验（略）2.11  样品中野黄芩苷的含量测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，分别进样测定，色谱图见图2，以外标法计算注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷

15、的含量。测定3批，每批测定3份。结果见表3。表3  样品中野黄芩苷含量（略） 3  讨论     本文采用HPLC法对注射用黄芩茎叶总黄酮中主要成分野黄芩苷进行含量测定，通过加样回收率及精密度实验，证明该方法简便、准确、可靠，可以用于控制该药制剂的内在质量。    通过对不同批次样品含量测定结果，建议注射用黄芩茎叶总黄酮中野黄芩苷含量应不低于0.200 mg/mg。 【 参考 文献 】   1国家医药管理局中草药情报中心站植物药有效成分手册M北京：人民卫生出版社，1986:946.2Moore P B, Day J P, Taylor G A, et al. Absorption of aluminium 26in AlzhEimer's disease, measured using accelerator mass spectrometryJ. Dement Geriatr cogn Disord, 2000, 11(2): 66.3Shang YZ,