黄芪注射液对培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的保护作用

1、    【摘要】  目的 研究黄芪注射液抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用。方法 采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型，实验分为六组：A正常对照组，B缺氧组，C黄芪20组，D黄芪100组，E黄芪200组，F黄芪400组。黄芪各组缺氧过程中给予不同浓度黄芪，缺氧4 h，复氧2 h。比较缺氧复氧前后心肌细胞存活率，培养液中心肌酶含量。结果 各组缺氧前后谷草转氨酶(GOT)均有差异。复氧后2 h，B、C、D组培养液中心肌酶含量均有不同程度升高(P0.05)。E、F组GOT值较基础值降低(P0.05)。与正常组比较，各组细胞经过缺氧复氧后，

2、存活数均有不同程度下降(P0.01)。与缺氧复氧组比较，加入黄芪保护的黄芪20，黄芪100，黄芪200组均优于单纯缺氧复氧组。黄芪200组存活率最高(P0.01)。结论 黄芪能够减轻培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤。 【关键词】  再灌注损伤心肌保护细胞培养流式细胞术细胞低氧The Protective Effect of Astragalus Injection on    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the protective effect of astragalus injection on

3、reperfusion injury cardial myocytes. METHODS  Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h. Astragalus injection was applied to cells during ischemia/reoxygenation and the extent of cell death and myocardial enzyme was

4、 determined after 120 minutes of reperfusion. RESULTS  In cells, incubation with astragalus during reoxygenation attenuated the extent of cell damage and also reduced the number of apoptotic cells. CONCLUSION  This study shows that astragalus attenuates cardiac myocytes injury du

5、ring reperfusion.    Key words：  Astragalus; Cardioprotection;Cell culture; Cell hypoxia    提高心肌保护效果是心血管外科不断发展的要求。通过药物方法进行心肌保护标志着其中的一大进步。本研究采用培养心肌细胞探讨黄芪注射液的抗再灌注损伤作用，尝试为中药在心肌保护中的应用提供理论依据。    1  材料与方法    1.1  原代心肌细胞培养  13

6、日龄Sprague Dawley大鼠（由解放军总医院实验动物中心提供），纱巾法培养1。0.25%胰酶消化培养瓶内单层细胞制备单细胞悬液，按实验要求的细胞量获取原代心肌细胞。接种于培养瓶或培养板内。37，5%CO2饱和湿度培养箱（REVCO公司，美国）内培养24h使细胞贴壁生长。经鉴定90以上为心肌细胞，90以上为活细胞即可用于实验。    1.2  缺氧/复氧心肌细胞模型制备  制备单细胞悬液，按实验要求细胞数目接种于培养板或培养瓶内。37，5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h使细胞贴壁生长。实验前更换含1%胎牛血清DMEM培养液培

7、养24 h。更换相应缺氧缓冲液。缺氧缓冲液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose 10 mM, sodium lactate 20 mM)2为高钾低pH(pH 6.2）溶液，更好地模拟了心脏中的细胞暴露于无氧条件的情况。其后将细胞置于用配气（95%N2+5%CO2，北京普莱特斯公司）饱和的容器中，向其中持续充入配气，燃蜡熄灭后再饱和10 min，充分驱赶容器中的氧气后迅即密封容器，放入孵箱37，培养4h。4h后恢复有氧环境，倾去缺氧缓冲液，换正常10血清DMEM培养基后将细胞置于5%CO2孵箱

8、中，于复氧条件下继续培养2h，造成心肌细胞缺氧复氧损伤。    1.3  黄芪浓度对缺氧/复氧细胞凋亡影响  六个培养瓶细胞，每培养瓶细胞总数1×106，培养瓶随机分为6组，编号为A组，B组，C组，D组，E组，F组。A组正常对照组，不加入黄芪，也不进行缺氧复氧处理。B组，C组，D组，E组，F组均为缺氧复氧组，其中黄芪终浓度依次为0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml黄芪培养液。实验开始时B组，C组，D组，E组，F组更换相应缺氧培养液，黄芪注射液终浓度分别为0 l/ml，20 l/m

9、l，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml，37孵育缺氧培养4h。复氧时各组更换含相应浓度黄芪的10%胎牛血清DMEM培养液入培养箱培养2h；正常对照组A组实验过程中入培养箱培养6h。    实验结束时，六组细胞经0.25%胰酶消化制备单细胞悬液，磷酸盐缓冲液离心洗涤2次(1000rpm，3 min)。细胞沉淀加入5 l Annexin-V-FITC染液室温避光染色10 min。加入5 l PI染液室温避光染色10 min。加入400 l 缓冲液重悬细胞沉淀后入流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）进行检测（凋亡检测试剂盒Annexin-V-FITC

10、 Apoptosis Detection Kit 1：BD Pharmingen BD Biosciences）。    1.4  黄芪对缺氧/复氧细胞培养液心肌酶的影响  制备单细胞悬液接种于24孔板内，每孔接种3 ml细胞悬液（3×104个细胞/孔）。37，5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h使细胞贴壁生长。更换培养液，每板四组，各复5孔。黄芪注射液终浓度分别为0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml培养液。37孵育。于24 h后取培养液0.5 ml在全自动生化分析仪上测定心肌

11、酶。    1.5  统计方法  采用SAS软件v8.2版本进行统计学分析。平均值以均数±标准差(±s )表示，心肌酶缺氧前和缺氧后组间两两比较采用单因素方差分析，各组缺氧前后比较采用配对t检验。组间存活细胞数比较采用X2检验。P0.05表示差异有统计学意义。    2  结  果    2.1  培养液心肌酶的变化  单因素方差分析显示，缺氧前组间两两比较结果显示，谷草转氨酶(GOT)基础值无统

12、计学差异(P0.14270.05)。缺氧后组间两两比较结果显示，E组,F组与其它各组均有差异，E组和F组之间也有差异。配对t检验结果显示，各组缺氧前后GOT均有差异。复氧后2h，B组、C组、D组均有不同程度升高，P0.05。E组、F组GOT值较基础值降低，P0.05，见表1。 表1  黄芪对复氧心肌细胞GOT的影响    2.2  黄芪对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响  研究黄芪浓度对复氧心肌细胞存活数的影响显示，与A组比较，各组细胞经过缺氧复氧后，存活数均有不同程度下降，P0.01。与B组比较，加入黄芪保护的C组，D

13、组，E组均优于B组。E组存活率最高。差异有统计学意义，P0.01。 见表2。 表2  不同浓度黄芪对复氧心肌细胞存活数的影响 注：与A组比较，P0.01；与B组比较P0.01    3  讨  论    心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)是指缺血期处于可逆损伤的心肌细胞经恢复血液供应后转化为不可逆损伤。再灌注过程挽救存活心肌细胞的同时，也会带来细胞的损伤。再灌注损伤时，主要通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量氧自由基聚集，致膜脂质过氧化3，促使氧自由基增多，加重

14、再灌注损伤4。再灌注损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题。其机制复杂,涉及多种细胞外信号分子、细胞膜上信号接收器、细胞内信号转导通路及其效应等多方面的变化,并在多层次和诸多环节存在交互作用5。    心肌缺血-再灌注、氧化应激损伤可导致心肌细胞凋亡。由于细胞凋亡是受一系列程序控制并通过信号通路介导的病理过程，阻断心肌细胞凋亡的信号通路将有助于阻断凋亡发生，防止心肌细胞数目的减少，维持或改善心功能6-7。目前的治疗策略着眼于添加某些抗再灌注损伤的药物，减轻再灌注引起的细胞死亡。针对再灌注时相抗细胞凋亡机制的治疗方法，有可能是减轻再灌注引起细胞死亡的潜在方法

15、8。    黄芪能保护心肌细胞，研究表明黄芪治疗后24h即可使组织线粒体SOD水平明显高于对照组，而丙二醛水平则明显低于对照组4。电镜下观察到使用黄芪保护的心肌细胞的形态、细胞膜、细胞核、线粒体等超微结构的改变明显轻于对照组3。大量实验证明,黄芪能稳定缺血心肌膜，通过对线粒体和溶酶体的保护，对心肌细胞缺血缺氧有直接保护作用9-10。电子自旋共振波谱仪观察到黄芪总黄酮能减少大鼠心肌缺血-再灌注自由基的产生11。黄芪注射液抑制心肌细胞凋亡的机制可能与几方面有关12：黄芪扩张冠状动脉，改善心肌血供；黄芪提高SOD活性，清除氧自由基；黄芪扩血管效应；抑制免疫系统的诱导、激活和调控，

16、减少TNF-的生成，从而抑制激发胞内凋亡通路；黄芪可抑制凋亡加速基因bax的表达，从而减少心肌细胞凋亡的发生。增加cAMP的含量，从而发挥正性肌力作用。也有研究发现黄芪可能是通过NO-sGCcGMP介导的信号转换通道，调节血管平滑肌细胞(VSMC)的功能，从而调整血压、血流。NO 是近年来发现的一种结构简单，半衰期短且化学性质极其活泼的气体信息分子，兼有信使、神经递质和细胞毒性等多种作用，广泛参与体内多种生理活动，与许多疾病的发生、发展有密切关系。实验发现，各实验组心肌内NO含量及NOS活性均显著高于对照组，此增高的NO可能参与对心肌的损伤。而经黄芪治疗后NO明显下降，NOS接近正常，结果是否

17、与黄芪抑制心肌内NOS2基因表达有关尚需进一步探讨11。【参考文献】  1 何蕾,张莉,黄靖香.乳鼠心肌细胞的体外培养及生物学特性研究 J.解放军医学杂志,2007,32(5):495-497.2 Di Napoli P, Taccardi AA, Grilli A, et al. Chronic treatment with rosuvastatin modulates nitric oxide synthase expression and reduces ischemia-reperfusion injury in rat hearts J. Cardiovasc R

18、es,2005,66 (3): 462-471.3 Flaherty JT，Zweier JL. Role of oxygen radicals in myocardial reperfusion injury：experimental and clinical evidence J. Klin Wochenschr,1991,69（21-23）:1061-1065.4 郑曙云,徐建国,赵振中.参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 J. 中国中西医结合杂志, 2004, 24(6):541-544，548. 5 韩笑,刘建勋.心肌缺血再灌注损伤的细胞信号转导机制 J.中国药理学通报,2004,20(1):4-7.6 石永忠,肖卫