第八章DNA序列测定ppt课件

1、第十章第十章DNA序列测定序列测定主要方法主要方法n双脱氧链终止法双脱氧链终止法nPCRPCR法法n芯片法芯片法n化学降解法化学降解法 双脱氧链终止法双脱氧链终止法1 1、根本原理、根本原理n利用利用DNADNA在体外合成过程中，当双脱氧在体外合成过程中，当双脱氧核苷酸参与后，核苷酸参与后，DNADNA链合成会被终止，链合成会被终止，并产生了一系列长度不等，末端不同并产生了一系列长度不等，末端不同的的DNADNA片段，经过电泳分别后，即可从片段，经过电泳分别后，即可从胶片上读出相关的序列。胶片上读出相关的序列。n在一个模板在一个模板DNADNA的测序反响中，设置一套四种反的测序反响中，设置一套

2、四种反响体系，每一种反响体系除了加不同种类的响体系，每一种反响体系除了加不同种类的ddNTPddNTP外，其他成分一样。外，其他成分一样。n如在如在A A管中除参与管中除参与dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP、dTTPdTTP外，外，还需参与一定浓度的还需参与一定浓度的ddATP ddATP 32P32P标志标志 。n每种反响中可得到一套长度不等的的每种反响中可得到一套长度不等的的DNADNA片段，片段，经变性电泳分别，放射自显影，用只读法从经变性电泳分别，放射自显影，用只读法从下至上即可从图谱上读出下至上即可从图谱上读出DNADNA序列。序列。待测序列待测序列3，5，双脱氧

3、酶法测定双脱氧酶法测定DNADNA顺序顺序1 1引物及固定端引物及固定端加引物加引物3，5，3，5，3，5，以以2，、，、3，双脱氧三，双脱氧三磷酸磷酸 2，、，、3， dNTP)来中止来中止DNA的复制反响的复制反响加加32PdATP， dTTP， dGTP ，dCTP分成四份进展反响分成四份进展反响双脱氧酶法测定双脱氧酶法测定DNADNA顺序顺序2 2加加ddATP/klenow片断片断加加ddTTP /klenow片断片断加加ddGTP /klenow片断片断加加ddCTP /klenow片断片断3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，

4、3，加在序列加在序列胶之胶之A行行加在序列加在序列胶之胶之T行行加在序列加在序列胶之胶之G行行加在序列加在序列胶之胶之C行行单链模板单链模板DNA引物引物ddTTPddCTPddGTPddATP A C G T5C 35CA 35CAG 35CAGA 35CAGAT 35CAGATT 35CAGATTA 35CAGATTAG35CAGATTAGC35CAGATTAGCT35CAGATTAGCTC35CAGATTAGCTCA35CAGATTAGCTCAG3donghua PCR法法 n直接测序直接测序n循环测序循环测序n 直接测序直接测序n可以直接从粗制的生物样品中测出目的可以直接从粗制的生物样

5、品中测出目的DNADNA序列。序列。 n首先经过首先经过PCRPCR从样品中扩增出目的从样品中扩增出目的DNADNAn随后经过电泳将扩增产物的双链随后经过电泳将扩增产物的双链DNADNA同反响剩余同反响剩余的的dNTPdNTP及引物分开，回收及引物分开，回收PCRPCR扩增的扩增的DNADNA片段。片段。n对扩增产物进展测序反响。测序引物可以是扩对扩增产物进展测序反响。测序引物可以是扩增靶增靶DNADNA一对引物中的一条，也可以是能与一对引物中的一条，也可以是能与PCRPCR产物杂交的其他引物。产物杂交的其他引物。 循环测序循环测序循环测序循环测序普通普通PCRPCR引物引物一条引物一条引物

6、二条引物二条引物 底物底物脱氧核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸、双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸 脱氧核苷三磷脱氧核苷三磷酸酸 扩增方式扩增方式 线性线性指数指数原理单引物原理单引物PCR第一步，第一步，PCRPCR扩增的扩增的DNADNA经变性成单链方式，经变性成单链方式，第二步，第二步，32P32P标志的引物与其中的一条链退火，标志的引物与其中的一条链退火，第三步，在第三步，在DNADNA聚合酶的催化下发生链延伸聚合酶的催化下发生链延伸终止反响。终止反响。循环循环3030次左右次左右变性变性退火退火延伸终止延伸终止ddNTP化学降解法化学降解法n一个末端标志的一个末端标志的DNADNA片段在片段

7、在4 4组或组或5 5组互为组互为独立的化学反响中得到部分降解，其中独立的化学反响中得到部分降解，其中每一组反响特异性的针对某一种或某一每一组反响特异性的针对某一种或某一类碱基。经过化学降解的分子具有共同类碱基。经过化学降解的分子具有共同起点和不同的终点。将各组反响产物进起点和不同的终点。将各组反响产物进展电泳，经放射自显影即可读取其序列。展电泳，经放射自显影即可读取其序列。化学降解法测序系统中的特异修饰方法化学降解法测序系统中的特异修饰方法碱基碱基条件与特点条件与特点GpH8.0pH8.0下，用硫酸二甲酯对下，用硫酸二甲酯对N7N7进展修饰，使进展修饰，使C8-C9C8-C9键对碱基裂解具有

8、特异的敏感性键对碱基裂解具有特异的敏感性A+GpH2.0pH2.0哌啶甲酸使嘌呤环的哌啶甲酸使嘌呤环的N N原子质子化，导原子质子化，导致脱嘌呤，消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键致脱嘌呤，消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可翻开嘧啶环，后者重新环化成五元环后肼可翻开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去易于除去C在在1.5mol/L NaCl1.5mol/L NaCl存在下，只需胞嘧啶可与存在下，只需胞嘧啶可与肼发生明显可见的反响肼发生明显可见的反响AC在在9090，用，用1.5mol/L NaOH1.5mol/L NaOH处置，可使处置，可使A A位点位点发生猛烈断裂反响，而发生猛烈断裂反响，而C C位点断