洋葱生物技术育种课件

1、洋葱生物技术育种生物技术在洋葱育种上的应用洋葱组织培养洋葱远缘杂交洋葱雄性不育系分子标记的辅助选择洋葱的基因工程洋葱生物技术育种一、洋葱组织培养一、洋葱组织培养1、分生组织培养、分生组织培养洋葱茎尖培养有较多研究，多采用洋葱茎尖培养有较多研究，多采用MS培养基，并附加培养基，并附加BA和和NAA等生长调节物。等生长调节物。Phillips等发现，毒莠定等发现，毒莠定(picloram)对洋葱茎尖培养的对洋葱茎尖培养的效果比用效果比用NAA更好，实验证明，洋葱、更好，实验证明，洋葱、A. rifoliatum、阿尔泰葱、实亭葱等茎尖在含毒莠定和阿尔泰葱、实亭葱等茎尖在含毒莠定和6BA的培养基的培

2、养基上还诱导出了体细胞胚。上还诱导出了体细胞胚。洋葱生物技术育种2、器官培养、器官培养起始外植体材料种类多：鳞茎盘、幼叶、花器起始外植体材料种类多：鳞茎盘、幼叶、花器官、鳞片等官、鳞片等鳞茎盘组织作为外植体进行组织培养被认为是生产试鳞茎盘组织作为外植体进行组织培养被认为是生产试管苗的有效方法。管苗的有效方法。 花蕾和叶片也较容易诱导植株再生。花蕾和叶片也较容易诱导植株再生。Pike和和Yoo 等将等将洋葱未成熟花蕾培养在附加洋葱未成熟花蕾培养在附加5 mg/L 6BA和和NAA的的MS培养基上，从小花直接诱导出不定芽。培养基上，从小花直接诱导出不定芽。洋葱生物技术育种总苞被未开裂的幼嫩花序总苞

3、被未开裂的幼嫩花序(1.5-2.0cm)的愈伤诱导情况的愈伤诱导情况处理处理B2,4-D6-BA接种数接种数生成愈伤数生成愈伤数愈伤诱导率愈伤诱导率Treatment(mg/L)(mg/L)No. of explantsNo. of callusRate of callus inductionB- 10.51.0584882.76%B- 20.52.0302480.00%B - 30.54.0554785.45%B - 41.01.0605998.33%B - 51.02.0413687.80%B - 61.04.0584984.48%B - 72.01.0534686.79%B - 82.0

4、2.0382976.32%B - 92.04.0403587.50%B的平均的平均数数48.1141.4485.49%洋葱生物技术育种a. 外植体外植体A的愈伤组织；的愈伤组织；b. 外植体外植体B在在B5 + 1.0 mgL-1 2,4-D + 1.0 mgL-1 6-BA上的上的愈伤组织；愈伤组织；c. 增殖培养增殖培养4周后的愈伤组织；周后的愈伤组织；图2-1 洋葱离体再生体系的建立洋葱生物技术育种3、胚培养和试管受精、胚培养和试管受精 1966年年Guha首次报道授粉洋葱的子房和胚珠在首次报道授粉洋葱的子房和胚珠在Nitsch培养基上可以成培养基上可以成出植株和种子出植株和种子 Ead

5、y等用等用0.5-1.5 mm大小的洋葱幼胚在含大小的洋葱幼胚在含5 mg/L毒莠定的培养基上毒莠定的培养基上高频率诱导出体细胞胚及植株再生。未成热胚培养可以有效地拯救杂种高频率诱导出体细胞胚及植株再生。未成热胚培养可以有效地拯救杂种胚的败育，从而提高远缘杂交的成功率。胚的败育，从而提高远缘杂交的成功率。 成熟的合子胚培养也是胚培养的另一种类型。成熟的合子胚培养也是胚培养的另一种类型。 Luther和和Bohanec用两步法培养获得再生植株。该法先将成熟期花在用两步法培养获得再生植株。该法先将成熟期花在含含2 mg/L 2，4-D和和6BA的培养基上培养的培养基上培养6d后，再将花或分离的子房

6、后，再将花或分离的子房转入含转入含2 mg/L TDZ( thidiazuron)的分化培养基上直接再生出苗。的分化培养基上直接再生出苗。洋葱生物技术育种4、原生质体培养与体细胞杂交、原生质体培养与体细胞杂交王光远等首次将洋葱叶肉原生质体在附加2,4-D,和6BA的MS培养基上培养获得愈伤组织，转移到NAA和KT的培养基上后获得了小植株的分化。Hansen等将洋葱悬浮细胞系分离的原生质体培养得到再生苗。葱属植物原生质体再生体系的建立可能应以培养细胞，特别是培养的胚性细胞来分离原生质体为宜。受原生质体再生体系难以建立的限制，葱属植物原生质体融合和体细胞杂交成功的报道极为罕见。直到1998年，Bu

7、iteveld等报道获得了韭(A.ampeloprasum)与洋葱体细胞杂种再生植株。这是至今得到的唯一成功的葱属植物种间体细胞杂种。洋葱生物技术育种5、洋葱单倍体诱导、洋葱单倍体诱导意义历史 Muren 1989首次利用未授粉胚珠培首次利用未授粉胚珠培养获得单倍体养获得单倍体培养方式：未授粉的胚珠、子房、花蕾未授粉的胚珠、子房、花蕾（开花前（开花前35天）天）研究方向：提高再生频率、染色体加倍、提高再生频率、染色体加倍、遗传稳定性遗传稳定性 洋葱生物技术育种洋葱生物技术育种Media composition on haploid induction frequency Salt：B5或或BD

8、SRegulators： 2mg/l BA + 2mg/l 2,4-DLiliana EM(2000) putrescine（腐胺）（腐胺） 预培养预培养15天，再培养于添加天，再培养于添加spermidine （亚精胺）的培养基上提（亚精胺）的培养基上提高了再生频率高了再生频率洋葱生物技术育种Genotype on haploid induction frequency the effect of donor genotype has the highest influnce on the haploid induction rate. Muren 1989 ，2.5% 5-7.6% （Bo

9、hanec, et al 1995, B.Campion, et al 1992, 1995. M.Jakse, et al, 1996 ）Bohanec and Jakse(1999) 18.622.6% for line and 51.7% for individual plants洋葱生物技术育种Chromosome doubling. 2.5mM of colchicines or 50M of oryzalin （Geoffriau E. et al 1997 ）洋葱生物技术育种二、远缘杂交二、远缘杂交大葱大葱( (A. f istu losum L. ) )具有许多洋葱缺乏的具有许

10、多洋葱缺乏的抗性基因抗性基因, ,且与洋葱同属且与洋葱同属, ,一直是洋葱种间杂交的一直是洋葱种间杂交的首选材料。首选材料。洋葱作为母本或父本与大葱杂交获得的洋葱作为母本或父本与大葱杂交获得的F1都具有中间都具有中间形态性状，纤细的鳞茎，偏向大葱的叶部形状，花杯状形态性状，纤细的鳞茎，偏向大葱的叶部形状，花杯状,花序和开花时间都处于两亲本的中间，花序和开花时间都处于两亲本的中间，F1都高度不育都高度不育。洋葱生物技术育种A-1:洋葱洋葱;A-2:洋葱洋葱大葱大葱; A-3:大葱大葱洋葱洋葱;A-4:大葱。大葱。B-1:洋葱洋葱;B-2:洋葱洋葱大葱大葱; B-3:大葱大葱洋葱洋葱;B-4:大葱

11、。大葱。C:洋葱洋葱;D-F:杂种杂种F,; G:大葱大葱洋葱生物技术育种己获得洋葱己获得洋葱“大葱大葱洋葱，洋葱洋葱，洋葱大葱，大葱，洋葱洋葱A oschaninii，洋葱，洋葱x实葶葱，洋实葶葱，洋葱葱大葱大葱A roylei种后代。种后代。洋葱生物技术育种洋葱雄性不育系的细胞学形态观察 Holford P(1991)研究洋葱S型雄性不育系1.在小孢子的四分体阶段，绒毡层细胞未成熟就退化 。2.在小孢子二分体阶段，绒毡层过度生长、肥大，随后自溶。 3.绒毡层形态完全正常，只是存在的时间过长。三、洋葱雄性不育系的研究进展三、洋葱雄性不育系的研究进展洋葱生物技术育种 Restriction F

12、ragment Length Ploymorphism (RFLP) marker The onion genome belongs to the group of large genomes There are almost no signals observed after the hybridization for RFLP analysis The sensitivity of the southern hybridization technique would have to be increased. In contrast to the nuclear genome, the o

13、rganellar genome can easily be analyzed by means of southern hybridization 洋葱生物技术育种洋葱的全基因组十分庞大洋葱的全基因组十分庞大,有有17.9 pg ( Labani等等.1987).大约大约153亿碱基对亿碱基对,是玉米全基因组的是玉米全基因组的6倍、番茄的倍、番茄的16倍、倍、拟南芥的拟南芥的107倍。倍。洋葱生物技术育种洋葱雄性不育分子标记的研究 q细胞质不育基因的标记 1.RFLP标记(mtDNA and cpDNA) 2.基于PCR的标记q恢复基因位点的标记 洋葱生物技术育种细胞质不育基因的细胞质不育基

14、因的RFLP标记标记De Courcel等等 (1989)以以BamHI和和Hind为内切酶，为内切酶，获得了可以区别洋葱获得了可以区别洋葱S型型和和T型、型、N型型的的mtDNA的的RFLP标记标记Holford 等等1991以以6种内切酶处理种内切酶处理mtDNA和和cpDNA，以以cox-3, cox-1, cox-2, cob, atp6 and atp9 探针，探针，S型型和和T型、型、N型型胞质的胞质的mtDNA的的RFLP标记标记 由此推断，由此推断，S型胞质是洋葱的外源胞质，型胞质是洋葱的外源胞质，T型胞质是洋葱型胞质是洋葱的内源胞质的内源胞质 洋葱生物技术育种 Havey(1

15、995)还发现可以区分S、N胞质5个cpDNA 的RFLP标记， 其中一个标记是N胞质的cpDNA上一段100bp核甘酸序列的插入 ，trnT和trnL两个基因间的间隔区 洋葱生物技术育种细胞质不育的PCR标记Havey (1995)23首次报道了洋葱细胞质雄性不育PCR标记trnT和trnL两个基因间保守序列 PCR扩增获得了可区别洋葱S和N胞质的的特征谱带（1kb or 1.1kb）。洋葱生物技术育种Alcala J等等 1999的研究成果的研究成果S型与N型上cpDNA 基因间非转录区，存在单核甘酸差异的多态性及串联重复的多态性标记。在此基础上，通过PCR分析，也可快速鉴定洋葱的S或N胞

16、质。洋葱生物技术育种mtDNA 的PCR鉴定(Sato Y1998) S型胞质线粒体cob基因上游有一个叶绿体同源的orf1708基因的插入 插入系列上游的两侧核甘酸系列为引物，进行PCR扩增获得了区分S（414bp）和N(180bp)胞质的特征谱带 洋葱生物技术育种 Engelke(2003)获得鉴定洋葱三种不同胞质的PCR标记 细香葱mtDNA 上atp9特定序列为引物，PCR扩增获得区分S型、 T型胞质与N型胞质的特征谱带 cob基因的上游特殊序列为引物，进行PCR扩增 S型与T型胞质洋葱生物技术育种试验1cob 标记试验标记试验 引物：引物：S型型的特异引物为，的特异引物为，5-GTC

17、CAGTTCCTATAGAACCTATCACT-3 N型胞质型胞质的特异引物为的特异引物为5-TCTAGATGTCGCATCAGTGGAATCC-3， 共用的共用的引物为引物为5-CTTTTCTATGGTGACAACTCCTCTT-3。 洋葱生物技术育种结论洋葱生物技术育种试验试验2引物为5ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC3与5CCAAGCATTTGGCGCTGAC3， 洋葱生物技术育种结论结论洋葱生物技术育种orfA510标记和标记和5cob标记结合使用标记结合使用鉴定洋葱的不育胞质鉴定洋葱的不育胞质洋葱生物技术育种恢复基因位点的标记恢复基因位点的标记 以以S型洋葱雄性不育系与其恢复系杂交后型洋葱雄性不育系与其恢复系杂交后代的代的F2群体群体为材料为材料获得了三个与获得了三个与Ms位点连锁的具有多态性位点连锁的具有多态性的的RFLP标记标记与与Ms为的连锁距离分别为为的连锁距离分别为0.9 、1.7和和8.6 cM。 洋葱生物技术育种洋葱基因工程洋葱基因工程洋葱转基因技术的相关报道也较少，大多数单子叶植物在细胞内洋葱转基因技术的相关报道也较少，大多数单子叶植物在细胞内缺乏诱导缺乏诱导Vir蛋白表达的一些酚类物质，所以不易被根癌农杆菌蛋白表达的一些酚类物质，所以不易被根癌农杆菌侵染，侵染，Dommisse等等(1990)采用体外添