富血小板血浆制备技术及其组分的研究进展

1、Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2014, Vol. 28, No.121560富血小板血浆制备技术及其组分的研究进展付维力 李棋 李箭【 摘 要】 目的 总结富血小板血浆 (platelet rich plasma, PRP 的制备技术及其组分的研究进展。 方法 广泛 查阅近年国内外有关 PRP 的作用机制、 制备方法以及组成等相关文献, 并进行总结分析。 结果 PRP促进生物学修复 作用的发挥依赖于一系列序贯发生的级联细胞分子事件。 PRP 中含有高浓度血小板, 其激活后释放大量活性因子,

2、 还含 有少量的白细胞和红细胞。 PRP 的制备基于血小板的浓缩技术, 不同的制备技术获得的血小板浓度、 复苏率和组分也不 相同。 结论 PRP的制备技术目前尚无统一标准, 不同的制备方法获得的不同成分和不同浓度的 PRP , 为临床患者选 择最适合的个体化 PRP 产品奠定基础。【 关键词 】 富血小板血浆 制备技术 组分RESEARCH PROGRESS OF PREPARATION AND COMPONENTS OF PLATELET RICH PLASMA/FU Weili, LI Qi, LI Jian. Department of Orthopaedics, West China

3、Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China. Corresponding author: LI Jian, E-mail: hxlijian.china【 Abstract 】 Objective To review the research progress of the preparation and components of the platelet rich plasma (PRP. Methods The recent literature concerning the biological me

4、chanism, preparation, and components of PRP was analyzed and summarized. Results The biological function of PRP depends on a series of intricate cascade of cellular and molecular events. PRP contains different concentrations of platelets, which would release a large number of the activated molecules

5、, and also contains a small amount of white blood cells and red blood cells. The preparation of PRP is based on platelet concentration. Different preparation techniques would lead to different platelet concentrations, recovery ratios, and components. Conclusion There is no uniform standard for the p

6、reparation of PRP. Different preparation methods and technical parameters of PRP will get different components and different concentrations of PRP, which also provide a reference for clinicians to select the most appropriate PRP for individual patient.【 Key words】 Platelet rich plasma Preparation me

7、thod ComponentFoundation items: National Natural Science Foundation of China (81301560; China Post-doctoral Science Foundation (2012M521698富血小板血浆 (platelet rich plasma, PRP 含有超 过生理浓度数倍的血小板, 作为一种自体血来源的产 品, 因获取过程创伤较小、 制备简便及具有生物学治疗 潜能等方面的优点, 被广泛用于组织再生、 创面修复、 感染治疗和功能重建等领域 1-2。 PRP 不仅能释放大 量生长因子和细胞因子发挥重要的

8、生物学修复功能, 还参与了血小板凝固和纤维蛋白产生的止血和免疫应 答进程。 PRP 发挥生物学治疗作用有赖于血小板分泌 的蛋白分子和血浆信号蛋白等组分。目前, 对于用于 临床的 PRP 制备技术尚无统一标准, 不同制备技术获DOI :10.7507/1002-1892.20140337基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (81301560 ; 中国博士后科 学基金资助项目 (2012M521698作者单位 :四川大学华西医院骨科 (成都 610041通讯作者 :李箭, 教授, 博士生导师, 研究方向 :运动医学 /关节镜外 科, E-mail: hxlijian.china网 络 出 版 时

9、 间 :2014-11-21 17:12:28;网 络 出 版 地 址 :http:/www. 得的 PRP 所含的血小板浓度和组分也不同, 导致生物 学治疗效果各异 3-8。现就 PRP 的作用机制、 制备、 组 分等相关研究热点作一总结。1 PRP的作用机制PRP 生物学作用的发挥依赖于一系列序贯发生的 级联细胞分子事件, 通过多层次旁分泌 /自分泌的蛋 白因子介导损伤修复和组织再生过程。具体作用机制 为 :PRP 激活后, 血小板释放大量的活性因子促进组织 形成, 活性因子首先锚定相关细胞的增殖和迁移, 再介 导炎性反应和血管发生, 然后调控细胞外基质蛋白合 成和组织重塑 9。 PRP

10、能用于组织修复, 与其能释放 大量信号分子构建有利于组织重建的微环境有关 10。 此外, PRP 包含的生长因子和细胞因子在创伤愈合和 组织重塑过程中也发挥了重要作用 11-12。这些因子通 过激活细胞表面受体来调控基因表达, 介导细胞增殖、 分化, 以及参与基质降解和组织重建过程 13。 PRP 提 供的生长因子还能刺激新生血管形成, 并为受损组织中国修复重建外科杂志 2014年 12月第 28卷第 12期1561的再生增加血供和营养物质, 尤其是血供有限和细胞 更新较缓慢的肌肉骨骼组织, 如软骨、 肌腱、 韧带等 14。 新生的血管将带来新的细胞并清除受损组织的碎片。 PRP 促进组织愈合

11、的生物学机制及临床相关性见表 1。表 1 PRP的生物学机制及其临床相关性Tab.1 The biological mechanism of PRP and their clinical correlations生物学机制 Biological mechanism涉及的活性分子 Active molecule临床意义 Clinical value止血 15-16、 、 、 因 子, 血 管 性血友病因子, Ca 2+和凝 血 酶防止血液丢失和减少异体输血 免疫应答17-20趋 化 因 子, 包 括 CXCL7、 CCL5、 MCP-1和 IL-8; 生 长 因 子, 包 括 HGF和 TGF-

12、1介 导 炎 性 反 应, 控 制感染和缓解疼痛 血管生成 21-23VEGF , TGF-1, bFGF , PDGF , EGF , IL-8, 血管生 成素, CXCL12, 基质金属 蛋白酶 1、 2、 9, 内皮抑素, 纤维连接蛋白, 血管内皮 抑制因子和 2-巨球蛋白改 善 血 供, 治 疗 缺 性血坏死疾病 合成代谢 24TGF-1、 PDGF 、 脑 源 性 神 经营养因子 、 IGF-1促 进 基 质 合 成, 重 塑组织结构2 PRP的组分PRP 中含有高浓度血小板, 血小板激活后能释放 大量活性分子, 以及少量的白细胞和红细胞 25。血小 板是 PRP 中最主要成分, 其

13、在止血、 凝血及炎性反应等 生理及病理过程中发挥重要作用。 PRP 中血小板浓度 过高或过低都不利于组织愈合, 有学者提出最有利于 组织愈合的血小板浓度为 (1.53.0 106/L , 约为 全血血小板生理浓度的 38倍 26。在损伤炎症期后 立即使用血小板对组织愈合可发挥最大作用, 因此一 些学者认为 PRP 给药时机选择的重要性甚至高于所含 血小板的数量 27。PRP 还含有对组织愈合存在潜在促进作用的其他 细胞类型。 CD34+细胞是来源于循环血单核细胞的一 类干细胞, 能为组织愈合创造最佳微环境28。由于白细胞对健康组织存在潜在的损伤, PRP 制备时是否保 留白细胞仍存在争议。一方

14、面, 白细胞在组织重建和 免疫应答过程中发挥重要功能 ; 另一方面, 白细胞可能 加剧炎性反应, 例如在损伤炎症期, 白细胞中的中性粒 细胞产生过量的基质金属蛋白酶和 IL , 可能引起肌肉 损伤。中性粒细胞是对抗病原微生物和局部炎性反应 主要的防御系统, 它还释放大量的蛋白酶和活性氧来 对抗微生物 29。另一类白细胞即单核 -巨噬细胞, 来 源于循环血单核细胞, 有助于组织损伤至修复过程中坏死物质的清除。白细胞如单核和多核粒细胞可锚定 局部炎性反应, 适当的炎性反应有利于组织修复进程 ; 再者适当浓度的中性粒细胞还能控制感染 30。含有一 定浓度白细胞的 PRP 常用于预防关节置换和其他外科

15、 手术操作中可能发生的感染 31。 PRP 中通常含有少量 的红细胞, 红细胞的主要功能是携带氧气, 有利于组织 修复。此 外, PRP 中 的 PDGF 、 VEGF 、 bFGF 等 蛋 白 浓 度较高 32, 因此有学者提出含有特定浓度生长因子 的 PRP 有利于组织修复 33。 PDGF 是组织愈合初期 最关键的生长因子, 能促进相关组织细胞, 尤其是干细 胞、 成纤维细胞和软骨细胞的趋化和有丝分裂, 还能 趋化炎性细胞产生级联生长因子释放 ; TGF-能促进 细胞增殖和分化, 基质合成 ; VEGF 与内皮细胞表面受 体结合后促进内皮细胞迁移和有丝分裂, 刺激血管生 成 ; HGF

16、能协同 VEGF 促进血管化, 但其促进骨分化 作用尚不明确 ; bFGF 和 IGF 在组织修复、 成熟和重塑 阶段都发挥重要作用 34-35。 PRP 中还包括促迁移、 黏 附、 增殖和分化的细胞因子和黏附分子等, 如基质细 胞衍生因子 1激活介导细胞迁移和归巢到修复区。PRP 中各种生长因子在组织愈合的不同阶段和不同部 位发挥不同的作用, 形成错综复杂的信号分子调控网 络。此外, PRP 还能释放一些表现抑制作用的蛋白, 如 TGF-1。 PRP 中凝血酶的准确作用尚不明确, 凝血 酶是纤维蛋白原向纤维蛋白转化的前提条件, 还包括 血小板分泌生长因子, 有研究表明外源性凝血酶激活 PRP

17、 可能降低脱钙骨基质诱导成骨的能力 36。纤维蛋 白也是 PRP 重要成分, 它能产生一个合适的三维结构, 为修复细胞提供良好支架, 有利于生长因子的分泌和 组织修复, 还可收缩创面, 促进凝血, 刺激组织再生, 促 进创面闭合 37。3 PRP的制备3.1 PRP 的分离及采集方法PRP 的制备是基于血小板浓缩过程, 根据全血不 同成分的密度经梯度离心分离获得。首先无菌条件下 采集自体静脉血于抗凝管中。 PRP 制备中最常用的 抗凝剂是枸橼酸钠, 它是一种较弱的钙螯合剂, 可通 过抑制凝血和血小板功能达到抗凝效果, 用于 PRP 制 备副作用较小 38-39。将采集的自体静脉血采用 2次 离

18、心血浆提取法获得 PRP :第 1阶段为相对低速离心 (100 g , 离心 10 min , 使血浆和血小板与红细胞和 白细胞分开 ; 第 2阶段为相对高速离心 (400 g , 离心 10 min , 进一步浓缩 PRP 和分离贫血小板血浆组分, 获得最佳的血小板浓度 40。离心后,各成分根据比重Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2014, Vol. 28, No.121562不同分为 3层 :下层为红细胞, 中间层为白细胞和血小 板, 上层为淡黄色血浆层, 吸取中间层混匀即为 PRP 。

19、PRP 在抗凝状态下一般可保存 8 h。但目前对是否需 要进行第 2阶段离心仍存在争议, 部分商业化产品均 无这一步骤 41。3.2 血小板激活载体的选择PRP 必须通过激活血小板来释放生长因子, 因此 血小板激活载体的选择非常重要。既往研究采用牛凝 血酶作为血小板激活载体, 但近年研究表明其所含的 抗牛凝血因子 V 抗体可与人凝血因子 V 交叉反应, 引 起凝血功能障碍, 因此已不再使用 42。目前较常用的 血小板激活载体为氯化钙, 其优点是安全、 无朊蛋白 或病毒暴露风险, 但激活速度较慢, 活化血小板至少 需要 20 min43。近年来, 自体凝血酶试剂盒被认为是 安全、 快速、 高效的

20、血小板激活载体, 它是通过将 10%氯化钙和制备的少量 PRP 或血液混合装于带有负电 荷粒子 (例如玻璃纤维 的注射器中, 室温条件下孵育 1015 min, 然后过滤去除细胞和纤维蛋白成分, 即可 作为血小板激活载体用于激活血小板。采用该方法制 备的自体凝血酶, 常通过双针筒注射器与 PRP 同时注 射 36, 经自体凝血酶活化血小板后, TGF-1和 PDGF-AB 等生长因子会立即释放 44。3.3 不同制备方法对 PRP 组分的影响目前, 对于用于临床的 PRP 产品的制备技术尚无统一标准, 主要涉及 3个基本技术 :重力血小板封存 (gravitationalplatelet se

21、questration, GPS 技术 ; 标准 的细胞分离技术 ; 自体选择性细胞过滤技术 (血小板 过滤 。 不同方法制备的 PRP , 其组分有一定差异 45-47。 目前已有多种商业化 PRP 制备装置, 获得的血小板浓 度、 复苏率和组分均不相同 (表 2 。任何 PRP 产品最 终的血小板浓度取决于采集全血的体积、 制备系统、 离 心力与温度和时间、 血小板复苏率、 悬浮一定浓度血小 板的血浆体积、 白细胞和 /或红细胞的相对浓度、 凝血 酶的沾染、 保存方法与时间, 此外还与患者个体因素有 关, 如外周静脉血的参数、 有无并发症、 年龄和循环血 中生长因子和细胞组分等, 如血脂高

22、将增加血小板浓 度 48- 49。4展望目前, 不同的制备方法和技术参数可获得不同组 分和不同浓度的 PRP , 为临床医生根据不同患者需要 选择最适合的 PRP 产品奠定了基础。 除了制备方法外, PRP 的有效性还取决于使用方法、 患者个体差异及适 应证的选择等因素。相信随着这些问题的解决, PRP 将更好地向临床转化。5参考文献1 Arshdeep, Kumaran MS. Platelet-rich plasma in dermatology: boon or a bane? Indian J Dermatol Venereol Leprol, 2014, 80(1: 5-14.表 2

23、 PRP的制备装置、 血小板浓度、 复苏率和组分Tab.2 PRP preparation devices, platelet concentration, recovery ratio, and components制备装置 Device增加的血小板浓度Platelet concentration increase复苏率Recovery ratio组分 ComponentBiomet GPSTM 3.2倍 70%富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞 Harvest 4.6倍 65%72%富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞 SmartPrep24.0倍 富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞

24、BMAC TM 4.0倍 富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞 Symphony TM 富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞 3i PCCS 富血小板血浆, 白细胞, 少量红细胞 Haemonetics 46倍 75%浓缩血小板, 没有血浆、 白细胞和红细胞 Angel TM 4.3倍 70%浓缩血小板, 白细胞, 少量红细胞 MAGELLAN 5.1倍 76%浓缩血小板, 白细胞, 少量红细胞 AutoloGel System12倍 78%低浓度血小板血浆, 少量白细胞Smart Prep 低浓度血小板血浆, 少量白细胞Cascade Medical FIBRINET System12倍 7

25、8%富血小板纤维蛋白膜Choukroun 12倍 70%富血小板纤维蛋白, 白细胞GenesisCS 6倍 68%浓缩血小板, 白细胞Secquire 1.6倍 31%血小板和血浆Arthrex ACP 血小板和血浆Vivostat 6倍 65%富血小板纤维蛋白S&Ns CaptionTM 4.3倍 浓缩血小板, 没有血浆ATR -curasan Set 浓缩血小板, 没有血浆中国修复重建外科杂志 2014年 12月第 28卷第 12期 15632 Dhillon MS, Behera P, Patel S, et al. Orthobiologics and platelet rich pl

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