感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取流程

1、感受态细胞的制备过程 LB 液体培养基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl , 1%(W/V ,用固体 NaOH 调节 pH 为 7.07.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于 室温。摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; 0.1 mol/L CaCl2:称取 1.47 g CaCl22H 20(Amresco 分装溶于 100 mL去离子 水中,灭菌后存于 4; 离心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,灭菌; 培养试管,灭菌; 1 mL枪头,灭菌; 1 mL加样枪; 滤纸,用牛皮纸包好后灭菌; 10 mL量筒,灭菌; 5 mL移液

2、管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌; 冰,离心管架; 恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。1.接种空白大肠杆菌于 3 mL LB培养基中, 37剧烈震荡培养过夜;2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB培养基中扩大培养至 OD 650=0.3后,将 培养好的细菌置于冰上冷却 10 min;3. 4, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤 纸上,将培养基控干;4.用 40 mL 冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。冰 上放置 30 min;5. 4, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,再用 4 m

3、L冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于 4放置 1224 h以增加其敏感性 后使用。6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为 100 L每管,再加入 100 L甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。 ,于液氮或 -70冰箱中存放。 存于低温下的感受态细胞, 一定不能融解。 如果已经融解, 应丢弃, 而不能再冻结保存而继续使用。注意事项:1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为 JM109。空白菌可以于平板上划线后,用 Parafilm 包好后存于 4,也可将液体培养物存于 4。但如果要长期保存, 则应将细菌保存于 50%的甘油中,存于 -20或 -70。当接

4、种的细菌是来自于 -20或 -70存放的液体培养物时,接种应迅速,不等解冻,立即从表面刮下 一块冰后,将菌种迅速放回低温存放;2. 一般于 3 mL LB培养基中过夜培养 12 h后, 菌体已很浓, 可以进行扩大培养。 于 100 mL培养基中培养 23 h后,即可达到对数生长期。但有时如果由于存 放过久,或者已经过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时间会延长; 3.对 OD 值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取 3 mL测 OD 值。 开始可以每 30分钟检测一次,越到后面检测的时间就应该缩短;4.感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。因此,所有操作均应在超 净台上。 也可

5、以在实验台上进行, 但应在后面放一酒精灯, 所有操作都不能远 离火焰。 最好每次恰好做感受态之前, 将所有的枪头和管子都灭一下菌, 用酒 精棉球将加样枪的前端擦拭一遍;5.感受态细胞的细胞膜比较脆弱,因此一当用冰冷的 CaCl 2悬浮以后,即不能 剧烈震荡或快速抽吸;6.根据我们的经验,纯度较高的含结晶水的 CaCl 2可以得到好的实验结果;7.所有的枪头和管子均应干净。如果有可能,都尽量用新的。如果是用的回收 的枪头,一定要看管壁是否干净。8.扩大培养用的液体培养基体积可以调整。调整后的 CaCl 2溶液体积也按比例 作相应的放大或缩小。9.以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间

6、的延长而下降,所 以最好是现做现用。 存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。 而对于转 化 PCR 连接产物,建议用其它的感受效率更高的制备方法。本节后的附 4介 绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方法。质粒 DNA 的转化 LB 液体培养基:见感受态细胞的制备; LB 固体培养基:于液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉。 不用在灭菌前溶化琼脂 粉,灭菌完后,轻轻摇匀。注意不能剧烈摇动,否则可能会使培养基暴沸; LB 平板:将灭菌后的固体培养基冷至 60左右时, 倒入 90 mm的培养皿中 (约 30 mL。如果先前已加入了抗生素,则还应在超净台上晃动培养皿几次; 200 L枪头, 1.5

7、mL Ep管,灭菌; 42水浴;10 L, 200 L加样枪; 培养试管,灭菌; 恒温摇床,恒温培养箱; 菌液推棒; 抗生素储液,本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类,氨卞青霉素 (Amp (储液, 100 mg/mL,溶于无菌水中,工作浓度 100 g/mL,即每毫升 培养基取 1 L储液 ;四环素(Tet (储液, 5 mg/mL,先用 1/2体积的乙醇 溶解, 再加入 1/2体积的无菌水, 工作浓度 50 g/mL, 即每毫升培养基取 10 L储液。储液全部于 -20保存 ; 冰;1.如果是冻存的感受态细胞,先于冰上溶解;2.加入用于转化的质粒 DNA 1 L;3.冰上放置 30 m

8、in;4.于 42热击 60 s;5.迅速放于冰上, 5 min后进行下一步;6.将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管,该培养试管有已预热 至 37的 LB 液体培养基,使总体积为 1 mL,温和震荡(200 rpm左右培养 1 h;7, 将复苏的培养物倒入一 Ep 管中, 4, 4 000 rpm离心 10 min, 将培养基倒掉,用残留的培养基悬浮,然后用加样枪将菌液加到 LB 平板上,用推棒涂布直至 培养基表面无可见的液体,将有培养基的一面向下培养约 30 min 后,倒置培 养过夜。注意事项:1.热击时间要根据所用管子的传热效率,薄壁管子的传热效率高,热击时间可 以缩短到 4

9、5 s;2.热击时,要使水浴尽可能不要流动,热击后应迅速放回冰上;3.于 37复苏细菌时,不能加抗生素,摇动也不能太过于剧烈;4.对照的设置对于评价转化结果非常重要,将 10 L感受态细胞分别涂布于不 含抗生素或含有抗生素的平板上, 如果感受态细胞没有问题, 则应该在不含抗 生素的平板上生长,而在含有抗生素的平板上不能生长。5.一般转化细胞可以用其中的 1/3涂布一个平板, 2/3涂布一个平板。不过,对 于多拷贝质粒,也可以不用离心,取 50 L涂布一个平板足矣。质粒 DNA 的提取 储液:100 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0:称取 Tris 12.1 g, 用浓 H

10、Cl 调节 pH 为 8.0, 然后定溶至 100 mL, 灭菌后存于 4; 100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0:称取 18.6 g 二水乙二胺四乙酸二钠,加 80 mL 去离子水,加热溶解,用固体 NaOH 调节 pH 为 8.0, 然后定溶至 100 mL, 灭菌后存于 4; 100 mL 10% SDS, 称取 10 g十二烷基硫酸钠于 80 mL去离子水中, 加热溶解后存于室温; 2 mol/L NaOH 10 mL, 称取 0.8 g固体 NaOH 溶解, 定溶至 10 mL, 于塑料瓶中室温存 放,可以不灭菌。 溶液 I :每配制 100 mL, 称取葡萄糖

11、 0.9 g (50 mmol/L, 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 2.5 mL (25 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH8.0 2 mL (10 mmol/L,定溶至 100 mL ,灭菌后存于 4; 溶液 II :现用现配,每 100 L需要 2 mol/L NaOH 10 L (0.2 mol/L, 10% SDS 10 L (1%,然后加 80 L无菌水; 溶液 III :每 100 mL 称取 KAc 49.1g, 于 70 mL 去离子水中溶解,然后加入冰 乙酸 11.5 mL,定溶至 100 mL后,灭菌存于 4; TE (pH 8.0:每

12、 100 mL取 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0储液 1 mL (10 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0 0.2 mL (1 mmol/L,定溶至 100 mL后,灭菌存于 4; 无 DNase 的 RNaseA :将 RNaseA 溶于 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5, 15 mmol/L NaCl 中,使终浓度为 10 mg/mL,于 100加热 15分钟,缓慢冷至室温,然后 存于 -20; Tris 饱和酚 (pH 8.0; 氯仿 /异戊醇(24:1 ; 100%乙醇与 70%乙醇,均于 -20存放; 1.5 mL Ep管

13、, 200 L及 1 mL枪头,灭菌;40 L, 200 L, 1 mL加样枪; 滤纸, 1.5 mL Ep管; 冰;1.接种一单菌落于 3 mL 含相应抗生素的培养试管中,于 37剧烈振荡培养过 夜;2.将全部培养物分两次倒入 1.5 mL Ep管中 ,12 000 g 离心 1 min收集细胞 ;3.将 Ep 管倒置于一干净滤纸上,将培养基尽可能流尽;4.将细菌沉淀重悬于 200 l冰预冷的溶液 I 中,剧烈振荡使细菌沉淀分散;5.加 400 L新配制的溶液 II ,盖紧管口,轻柔的快速颠倒 Ep 管 510次,然 后将 Ep 管于冰上放置 5 min;6.加 300 L用冰预冷的溶液 I

14、II ,盖紧管口,将 Ep 管颠倒混合 15次左右,然 后将 Ep 管于冰上放置 5 min;7. 2, 12 000 g 离心 5 min ,将上清转入另一 Ep 管,加等体积的酚 /氯仿,振 荡混匀, 2, 12 000 g 离心 5 min;8.吸出上清,再加等体积的氯仿抽提;9.在吸出的上清中加入 2倍体积冰冷的乙醇于室温沉淀 2 min;10. 2, 12 000 g 离心 5 min,倒出上清,沉淀用 70%乙醇洗两次。然后倒置于一滤纸上,让乙醇挥发干净;11.高拷贝质粒溶于含 5 L RNaseA的 50 l TE中;低拷贝数质粒减半。注意事项:1.细菌培养时间不宜过长,一般以

15、1216 h 为宜,如果培养时间过长,培养物 会非常粘稠,这会导致离心沉淀的困难;2.一般细菌培养好以后,应该马上提取。如果不能马上提取,于 4存放时间 不能过长;2.加溶液 I 分散细菌沉淀比较关键,如果分散不好,将直接影响产率;3.溶液 I 加入后,溶液会非常浑浊,加入溶液 II 颠倒几次后,溶液变清,打开 管口,会发现溶液呈鼻涕样,加入溶液 III 颠倒后,会发现有沉淀物形成,该 沉淀物位于溶液上层。 如果发现沉淀不能自动聚集, 而是呈烂棉花状, 且离心 后不能沉到管底,则预示着实验的失败;4.培养基的成分非常复杂,如果去除得不太干净,则有可能影响到后面的酶切 效果;5.乙醇必须去除干净

16、,否则会造成电泳点样时上漂;但样品又不能干燥太久, 否则有可能使得质粒 DNA 沉淀难于溶解在 TE 中。6. SDS 在低温下会析出结晶,因此配制溶液 II 时应先于 60溶解;7.如果一次要提多个样品,可以先一起配制溶液 II ,而后加入每管。但配制时 应略大于所需要的量;附:1.苯酚的平衡 重蒸苯酚 8-羟基喹啉 水浴锅 固体 Tris 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0: 称取 6.055 g Tris,溶于 800 mL蒸馏水中,用浓HCl 调 pH 为 8.0,定容到 1 L。1.将重蒸酚于 65水浴融化;2.取 100 mL融化的重蒸酚于一 250 mL烧杯中,

17、马上加至少等体积的蒸馏水, 同时加入 0.1%苯酚体积的 8-羟基喹啉,然后加入少量的固体 Tris ,当 Tris 溶 解后,可看到液面分层出现,加 Tris 用 7.68.5的精密 pH 试纸调 pH 为 8.0 (待加入的 Tris 溶解充分后,停止搅拌,待分层完全出现后,再用 pH 试纸测 上相的 pH 值 。3.将上清吸出,加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0,充分搅拌后,测定上清的 pH 值。如果不到 8.0,则还需要调节。4. 将上清吸出, 再加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0, 充分搅拌后, 吸出上清, 但要在液面上保留

18、一层液体。倒入棕色瓶中,于 4保存。这样的饱和酚可以 使用 2个月。 如果超出 2个月, 则应倒入专用的盛装回收酚的棕色瓶中, 再重 新平衡。注意:1. 酚有强烈的腐蚀性,所以操作时一定要小心,注意不能溢出或溅出,并且要 戴手套。如果 不小心溅到皮肤上,用大量的水冲洗,切忌用乙醇! !2. 由于酚的腐蚀性,所以不用 pH 计调 pH 值,只能用 pH 试纸。3. Tris一定要溶解充分后,再测定 pH 值。2.核酸样品中蛋白质的去除 3 mol/L NaAC(pH 5. 2 :称取 40.824 g NaAc3H 2O 或无水 NaAc 24.6 g,溶于 30 mL水中, 加 HAc 调 p

19、H 至 5. 2, 用水定溶至 100 mL(调 pH 时,愈到后面, 愈应小心 。然后灭菌存于 4。如果是浓缩 RNA ,还要用 DEPC 处理后再灭 菌。 枪头和管子:根据纯化样品的不同而采取不同的处理方式,纯化 DNA 时只需 灭菌,纯化 RNA 时则需要 DEPC 处理后再灭菌。 Tris 饱和酚 (pH 8.0; 氯仿 /异戊醇(24:1 ; 冻存于 -20的无水乙醇和 70%乙醇1. 在核酸样品中加入 1/2样品体积的 Tris 饱和酚和 1/2样品体积的氯仿 /异戊醇, 混匀后,于 2, 12 000 rpm离心 5 min,将上清转入一新管中,重复酚 /氯仿 抽提直至界面无可见

20、的沉淀物为止。2. 加入 1倍样品体积的氯仿 /异戊醇, 混合均匀后, 于 2, 12 000 rpm离心 5 min, 将上清转入另一新管。3.加入 1/10终体积的 3 mol/L NaAC (pH 5. 2 ,再加入 2倍体积的冰冷的无水 乙醇,于 -20至少沉淀 3 h。4. 2, 12 000 rpm离心 15 min。沉淀用 70%的乙醇表面润洗 2次,将管倒置于 一滤纸上,空气中干燥。然后将样品溶于适量体积的溶剂中。注意:1.混匀方式要根据 DNA 和 RNA 而有所不同:RNA 混匀时,可以剧烈震荡, 而 DNA 只能用手颠倒混匀。2.吸取上清液应根据待纯化的样品是 DNA 还

21、是 RNA 而有所不同:DNA 吸取 要缓慢, RNA 则可以不加注意。3.所加乙醇的体积是以加了盐后的体积计算的。4. 如果待纯化的核酸样品量太少 (1g 或样品太稀 (0.01g/l, 则所加乙醇的 量应扩大到 2.53倍。3.核酸的浓缩以上所述的去除核酸中的蛋白质后, 再用乙醇沉淀即为核酸的浓缩。 如果核酸样 品已经很纯,则沉淀时无必要加入醋酸盐;如果核酸样品中还有杂质需要去除, 则还应加入醋酸盐(NaAc, KAc或 NH 4AC 。4.高感受效率感受态细胞的制备 E. coli JM109或其它菌种 LB 液体培养基 50 mL离心管 LB 固体培养基 LB 平板200 L枪头, 1

22、.5 mL Ep管,灭菌; 42水浴;10 L, 200 L加样枪; 培养试管,灭菌; 恒温摇床,恒温培养箱; 菌液推棒; 抗生素储液,本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类,氨卞青霉素 (Amp (储液, 100 mg/mL,溶于无菌水中,工作浓度 100 g/mL,即每毫升 培养基取 1 L储液 ;四环素(Tet (储液, 5 mg/mL,先用 1/2体积的乙醇 溶解, 再加入 1/2体积的无菌水, 工作浓度 50 g/mL, 即每毫升培养基取 10 L储液。储液全部于 -20保存 ; 冰; SOB 培养基 (1L; 蛋白胨 20 g, 酵母抽提物 5 g, NaCl 0.58 g, K

23、Cl 0.38 g,100镁离子母液 (每 100 mL含 MgCl 26H 2O 20.33 g, MgSO47H 2O 24.65 g 10 mL。 用 1 mol/L NaOH调 pH 至 7.0。 SOC 培养基:SOB+20 mmol葡萄糖(每 100 mL SOB培养基中加入 50%的葡 萄糖溶液 720 L。 0.5 mol/L CaCl2:7.35 g CaCl22H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中。 用 0.22 m 的微孔 滤膜过滤除菌。 1 mol/L KCl:7.45 g KCl溶于 100 mL ddH2O 中,高压灭菌。 0.45 mol/L MnCl2;

24、 8.9 g MnCl24H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中,高压灭菌。 0.5 mol/L(K-MES :9.76 g 2(-N-吗啡啉乙磺酸溶于约 80 mL ddH2O 中,用 KOH 调 pH 为 6.2,加水定容至 100 mL,用 0.22 m 的微孔滤膜过滤除菌。 分装后于 -20o C 保存。 二甲基亚砜(DMSO 。 TB 缓冲液:10 mmol/L K-MES (pH 6.2 (0.5 mol/L K-MES (pH 6.2 2 mL , 45 mmol/L MnCl 2 (0.45 mol/L MnCl 2 10 mL, 15 mmol/L CaCl 2 (0.5 mol/L CaCl 2 3 mL , 250 mmol/L