基因工程应用课件

1、1.1.技术解决化学技术解决化学( (生物生物) )工程问工程问题的基因工程策略题的基因工程策略n 传统的化学工程的核心是所谓的传统的化学工程的核心是所谓的“三三传一反传一反”，即：动量传递、热量传递、，即：动量传递、热量传递、质量传递和反应工程。质量传递和反应工程。n 在生物化学工程中，同样存在着这些在生物化学工程中，同样存在着这些问题。目前，生物化工工作者，通常是问题。目前，生物化工工作者，通常是通过物理或化学的方法来解决这些问题通过物理或化学的方法来解决这些问题的。的。问题的提出n 例如，在生物好氧发酵过程中，例如，在生物好氧发酵过程中，氧的供应是一个重要的问题，因为氧的供应是一个重要的

2、问题，因为氧在水溶液中的溶解度是很低的。氧在水溶液中的溶解度是很低的。因此，保证供氧往往成为菌体生长因此，保证供氧往往成为菌体生长和代谢的限制性因素。尤其为了提和代谢的限制性因素。尤其为了提高产品的产量和降低生产成本进行高产品的产量和降低生产成本进行大规模、高密度培养时，氧的供给大规模、高密度培养时，氧的供给和传递问题就更加突出。和传递问题就更加突出。一例生化工程问题n 通常的方法是加强搅拌和加大通气通常的方法是加强搅拌和加大通气量，甚至通富氧或在发酵液中加入可量，甚至通富氧或在发酵液中加入可高溶氧的物质（氧载体），来满足菌高溶氧的物质（氧载体），来满足菌体对氧的需求。无疑，这些措施都会体对氧

3、的需求。无疑，这些措施都会增加能耗和生产成本。有时甚至仍达增加能耗和生产成本。有时甚至仍达n不到高密度培养的要求。不到高密度培养的要求。 因此，提因此，提高氧的利用率是生物发酵过程中出现高氧的利用率是生物发酵过程中出现的一大难题。的一大难题。n 又例如：生物化工中，大多数基因又例如：生物化工中，大多数基因工程产品是胞内产物，即：产物积累工程产品是胞内产物，即：产物积累在细胞内。因此，在细胞培养或发酵在细胞内。因此，在细胞培养或发酵后，需要破碎细胞、释放胞内产物。后，需要破碎细胞、释放胞内产物。n 破碎细胞是生物产品后处理中一个破碎细胞是生物产品后处理中一个比较特殊和麻烦的操作过程。比较特殊和麻

4、烦的操作过程。 又一例生化工程问题n 传统的细胞破碎方法传统的细胞破碎方法有：有：n1 1、机械法、机械法、n2 2、溶剂萃取法、溶剂萃取法、n3 3、化学试剂法、化学试剂法、n4 4、酶法，等等。、酶法，等等。n 各种方法都有一定的各种方法都有一定的n缺陷和局限性。缺陷和局限性。n1 1、机械法机械法设备昂贵，产品变性；设备昂贵，产品变性；n2 2、溶剂萃取法溶剂萃取法溶剂回收，环境污染；溶剂回收，环境污染；n3 3、化学试剂法化学试剂法环境污染，产品变性；环境污染，产品变性；n4 4、酶法酶法n 操作复杂，操作复杂，n 条件苛刻，条件苛刻，n 需加外源酶。需加外源酶。n 生物技术有许多优点

5、，人们对此有生物技术有许多优点，人们对此有很高的期望，但是为什么生物技术没很高的期望，但是为什么生物技术没有在生产中得到预期那样快的发展呢？有在生产中得到预期那样快的发展呢？n 其原因很多，其原因很多，n其中一个重要的原因是生物技术本身其中一个重要的原因是生物技术本身在工程上存在着一些问题。在工程上存在着一些问题。生化产品生产中存在的问题生化产品生产中存在的问题n1 1、发酵成本高：、发酵成本高：n 培养基培养基组成复杂，原料昂贵；组成复杂，原料昂贵；n 供氧供氧加强通气加强通气/ /搅拌，搅拌，能耗高能耗高，通纯氧；，通纯氧；n2 2、回收成本高：、回收成本高： n 产物浓度低；产物浓度低；

6、n 杂质含量高；杂质含量高；n 分离提取困难。分离提取困难。n3 3、废物、废水的、废物、废水的 处理问题。处理问题。生化产品生产中存在的问题n 总起来：总起来：存在的主要问题：存在的主要问题：n在许多情况下，与其它生产法在许多情况下，与其它生产法n相比，往往生产成本较高相比，往往生产成本较高 。 基因工程的新作用n 随着生物技术的日益发展，可随着生物技术的日益发展，可以利用基因工程技术来解决化学以利用基因工程技术来解决化学工程的问题，从而实现高效生产工程的问题，从而实现高效生产和降低生产成本的目的。和降低生产成本的目的。n 这为基因工程的作用赋予了新这为基因工程的作用赋予了新的含意，即用基因

7、工程来解决化的含意，即用基因工程来解决化学工程问题。学工程问题。一个实例：n 以以聚聚-羟基丁酸酯（羟基丁酸酯（PHBPHB）n的生产为例：的生产为例：n这是一种用微生物发酵法生产的可生这是一种用微生物发酵法生产的可生物降解的高分子材料，它还具有生物物降解的高分子材料，它还具有生物相容性、压电性及低透氧性等许多独相容性、压电性及低透氧性等许多独特的优点。不仅可以在医药、电子等特的优点。不仅可以在医药、电子等高技术领域广泛的应用，并可望为解高技术领域广泛的应用，并可望为解决日益严重的决日益严重的“白色污染白色污染”问题带来问题带来希望。希望。n 但是，如上所述的那样，但是，如上所述的那样，n 在

8、在PHBPHB生产中生产中存在的主要问题也是：存在的主要问题也是：n 成本较高。成本较高。n 其原因是：其原因是： n 发酵水平低；发酵水平低；n 发酵成本高：发酵成本高：n 回收成本高：回收成本高： n 细胞可控裂解细胞可控裂解E. coli cell 透明颤菌血红蛋白基因透明颤菌血红蛋白基因 噬菌体裂解基因噬菌体裂解基因PHB PHB 合成基因合成基因提高氧利用率提高氧利用率高产率高产率低成本低成本 新菌株构建新菌株构建 生产生产PHBPHB的基因工程策略的基因工程策略为提高合成为提高合成PHBPHB的能力：的能力： 利用大肠杆菌快速生长和可利用廉价利用大肠杆菌快速生长和可利用廉价碳源等优

9、点，将合成碳源等优点，将合成PHBPHB的基因在大肠杆的基因在大肠杆菌中克隆和表达，以达到提高产量、降菌中克隆和表达，以达到提高产量、降低成本的目的。低成本的目的。利用利用烈性噬茵体裂解细胞壁烈性噬茵体裂解细胞壁在菌体中添加烈性噬菌体可以有效地裂解细在菌体中添加烈性噬菌体可以有效地裂解细胞胞, ,破细胞壁。破细胞壁。1994 1994 年报道了用年报道了用T4 T4 噬菌体来裂解噬菌体来裂解E. E. colicoli 细胞的方法。但由于烈性噬菌体不可控细胞的方法。但由于烈性噬菌体不可控, ,它的引入它的引入和散布不但会污染生产环境和散布不但会污染生产环境, ,给后续的培养带来很大的给后续的培

10、养带来很大的麻烦麻烦, ,甚至会危害到菌种甚至会危害到菌种, ,所以通常情况下所以通常情况下, ,这种方法是这种方法是不可取的不可取的, ,也是不实用的。这方面的报道也很少也是不实用的。这方面的报道也很少利用温和性噬菌体裂解细胞壁利用温和性噬菌体裂解细胞壁利用温和性噬菌体感染细胞利用温和性噬菌体感染细胞,获得溶源菌获得溶源菌,进而进而通过外在条件的变化来诱导细胞裂解通过外在条件的变化来诱导细胞裂解,这种破细胞这种破细胞壁的方法壁的方法,由于其可控由于其可控,所以相对于用烈性噬菌体裂所以相对于用烈性噬菌体裂解细胞的方法来说更具有吸引力。解细胞的方法来说更具有吸引力。利用克隆噬菌体裂解基因的方法破

11、细胞壁利用克隆噬菌体裂解基因的方法破细胞壁在温和性噬菌体中在温和性噬菌体中, E. coli 的的噬菌体是目前研噬菌体是目前研究得最清楚的。在研究感染了究得最清楚的。在研究感染了噬菌体的噬菌体的E.coli 的裂解时发现的裂解时发现,对细胞起裂解作用的主要是对细胞起裂解作用的主要是噬菌噬菌体体DNA 上裂解基因所编码的酶。上裂解基因所编码的酶。噬菌体的裂解噬菌体的裂解基因包括基因包括S、R 和和Rz 三个基因三个基因,其中其中R 基因的产基因的产物是一种可溶于水的转糖基酶物是一种可溶于水的转糖基酶( transglycosylase) ,可分解细胞壁的肽聚糖。该可分解细胞壁的肽聚糖。该酶与真正

12、的溶菌酶的不同之处在于酶与真正的溶菌酶的不同之处在于,它可以引起它可以引起肽键水解肽键水解,而溶菌酶却只使肽聚糖上相邻的而溶菌酶却只使肽聚糖上相邻的N2乙乙酰氨基葡萄糖残基间裂开。酰氨基葡萄糖残基间裂开。Rz 基因的产物可能是一种肽链内切酶基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopeptidase) ,它可以切割肽聚糖的寡糖它可以切割肽聚糖的寡糖之间和之间和/或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的交联。或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的交联。R 和和Rz 基因产物的功能是降解细胞壁基因产物的功能是降解细胞壁,而而S 基基因产物的作用是改变细胞质膜的通透性因产物的作用是改变细胞质膜的通透性,在细在细胞质膜上形成

13、多孔的结构胞质膜上形成多孔的结构,以使以使R 和和Rz 基因产基因产生的酶可以穿过细胞质膜生的酶可以穿过细胞质膜,到达细胞壁到达细胞壁,从而作从而作用于细胞壁用于细胞壁PHB biosynthetic genes (phbCAB) phbA -ketothiolase(-酮硫解酶酮硫解酶) phbB aceto-acetyl-CoA reductase(NADPH为辅酶的乙酰乙酰为辅酶的乙酰乙酰CoA还原酶还原酶) phbC PHB synthasePHB 合成基因来源于合成基因来源于：Alcaligenes eutrophus H16PHB 的合成的合成：为裂解细胞，释放胞内产物：为裂解细胞

14、，释放胞内产物： 将将噬菌体的裂解基因克隆在大肠杆噬菌体的裂解基因克隆在大肠杆菌中。使菌具有破壁温和、可控、简单、菌中。使菌具有破壁温和、可控、简单、无需加入外源酶等优点。可降低分离回无需加入外源酶等优点。可降低分离回收的成本，且提高了收的成本，且提高了PHBPHB产品的质量。产品的质量。 琥珀突变的琥珀突变的噬菌体裂解基因噬菌体裂解基因（S-RRz）：）： 位于长度为位于长度为1466bp1466bp的的EcoEcoR-R- Cla ClaDNADNA片段上片段上 Lytic genes from phage (S-RRz)功能：编码可裂解细菌细胞壁的几种酶功能：编码可裂解细菌细胞壁的几种酶

15、 S S 改变细胞膜的通透性，形成多孔结构；改变细胞膜的通透性，形成多孔结构； R R 产生可溶于水的转糖基酶，以分解细产生可溶于水的转糖基酶，以分解细 胞壁的肽聚糖；胞壁的肽聚糖； Rz Rz 产生肽链内切酶，可以切割肽聚糖寡产生肽链内切酶，可以切割肽聚糖寡 糖间及肽聚糖与胞壁外膜间的交联；糖间及肽聚糖与胞壁外膜间的交联；特性：特性：S S 基因琥珀突变解决了细胞壁裂解与菌体基因琥珀突变解决了细胞壁裂解与菌体生长和生长和PHBPHB积累的矛盾。积累的矛盾。 Lytic genes from phage (S-RRz)质粒的构建质粒的构建 为解决大规模、高密度培养时氧的为解决大规模、高密度培养

16、时氧的供需矛盾，提高菌体对氧的利用率：供需矛盾，提高菌体对氧的利用率： 在大肠杆菌中克隆和表达透明颤在大肠杆菌中克隆和表达透明颤菌血红蛋白基因。具有这种基因的菌血红蛋白基因。具有这种基因的菌株，能合成血红蛋白，提高对氧菌株，能合成血红蛋白，提高对氧的利用率和耐低溶氧的能力。从而的利用率和耐低溶氧的能力。从而降低发酵的成本。降低发酵的成本。透明颤菌血红蛋白（透明颤菌血红蛋白（VHbVHb）及其基因（）及其基因（vgbvgb）VHbVHb含含146146个氨基酸残基，有两个相对分子量为个氨基酸残基，有两个相对分子量为1577515775的亚基。的亚基。vgbvgb基因位于基因位于1.4kb1.4k

17、b的的Hind-SalHind-Sal片段上；片段上；Vitreoscilla hemogobin gene (vgb)VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中vgb vgb 的表达的表达VG1(pTU14) VG1(pTU14) 细胞的细胞的COCO差光谱在差光谱在 419nm 419nm 处呈现出处呈现出明显的透明颤菌血红蛋白的特征吸收峰。明显的透明颤菌血红蛋白的特征吸收峰。说明说明vgbvgb可以在可以在VG1(pTU14)VG1(pTU14)成功表达。成功表达。1 JM105 (pTU14) 2 VG1 (pTU14)How about the expressions of the

18、 three exogenous genes in VG1 (pTU14)?用用2 mM EDTA / 50 mM Tris (pH 8.0) buffer2 mM EDTA / 50 mM Tris (pH 8.0) buffer处理前后处理前后VG1(pTU14)VG1(pTU14)细胞的电镜观察细胞的电镜观察22h culture, magnification: 6600VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中 S S- -RRz RRz 基因的表达和调控基因的表达和调控VG1(pTU14)VG1(pTU14)的细胞和胞内积累的的细胞和胞内积累的PHBPHB颗粒颗粒 （裂解前）（裂解

19、前）从从VG1(pTU14)VG1(pTU14)细胞内释放出的细胞内释放出的PHBPHB颗粒颗粒 （裂解后）（裂解后）VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中 S S- -RRz RRz 基因的表达基因的表达5 h58 h37 h11 hPHB PHB 大量积累时大量积累时VG1(pTU14)VG1(pTU14)细胞细胞的自动裂解的自动裂解Magnification： 160050 h010203040506070050100150200250X, P, R (g/L)Time (h) X P R020406080100 P/X P/X (%)在优化条件下，经过在优化条件下，经过6060小

20、时的补料分批培养，小时的补料分批培养， VG1(pTU14)VG1(pTU14)的细胞干重达到：的细胞干重达到：216g/L 216g/L ， PHBPHB浓度：浓度：194g/L194g/L， PHBPHB占细胞干重：占细胞干重：90 %90 % 达到了国际上文献报道的高指标达到了国际上文献报道的高指标。VG1(pTU14)VG1(pTU14)在发酵罐中的补料分批培养在发酵罐中的补料分批培养这是一个化学这是一个化学( (生物生物) )工程工作工程工作者能创新性地发挥作用的舞台，者能创新性地发挥作用的舞台，必将得到进一步的发展。必将得到进一步的发展。 虫害是制约农作物高产的重要因素虫害是制约农

21、作物高产的重要因素,世界每年因虫世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。化以上。化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用用,如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。引起次要害虫的大发生等。 而通过基因工程手段培育抗虫新品种而通过基因工程手段培育抗虫新品种(系系)可从根可从根本上解决问题本上解决问题,对哺乳动物和一些有益昆虫不产生对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用毒害作用,且不造成环境污染且不造成环境污染,具有广阔的应用前具有广阔的应

22、用前景。景。 利用基因工程手段培育抗虫新品种有以下优点利用基因工程手段培育抗虫新品种有以下优点: (1)保护作用具有连续性保护作用具有连续性; (2)基因资源非常丰富基因资源非常丰富; (3)对害虫的毒性具有专一性对害虫的毒性具有专一性; (4)对害虫的毒害作用可不受时，空的限制对害虫的毒害作用可不受时，空的限制; (5)不易被环境因素影响不易被环境因素影响,也不对环境造成污染也不对环境造成污染; (6)育种周期短育种周期短,成本低成本低,目的性强。目的性强。 1.1 来源于微生物的抗虫基因来源于微生物的抗虫基因 1.1.1 苏云金杆菌毒蛋白基因苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt基因基因) Bt是苏云

23、金杆菌是苏云金杆菌Bacillus thuringiensi的简称的简称,是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌,其杀虫毒性来其杀虫毒性来自芽孢形成时所产生的具有自芽孢形成时所产生的具有高度特异性高度特异性杀虫活性杀虫活性的晶体蛋白的晶体蛋白,通常称为苏云金杆菌毒蛋白通常称为苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxic protein) 、杀虫结晶蛋白、杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein,ICP) 、 内毒素等。内毒素等。 通过克隆技术确定通过克隆技术确定Bt基因位于基因位于30150MD大小大小不同的质粒上不同的质粒上,其中毒性区间位于该序列其中毒

24、性区间位于该序列N端端29607个编码区个编码区,C端有高度的保守性端有高度的保守性,对稳定晶对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。体蛋白结构可能起着重要作用。 杀虫机理杀虫机理:其中其中,应用于农业生产的主要是应用于农业生产的主要是内毒素内毒素。已知。已知内毒素为内毒素为130160KD的多的多肽肽,在伴孢晶体内是以原毒素的形式存在在伴孢晶体内是以原毒素的形式存在,经经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成5570KD或更小的多肽或更小的多肽,与敏感昆虫中肠道与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞上的特异受体位点结合上皮纹缘细胞上的特异受体位点结合,并破并破坏纹缘膜细胞

25、渗透压平衡坏纹缘膜细胞渗透压平衡,使细胞裂解使细胞裂解,杀死杀死昆虫。昆虫。 分类分类:不同基因型杀虫谱不同不同基因型杀虫谱不同,毒蛋白的大小及形毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同状也不一样。根据杀虫谱的不同,将杀虫基因分成将杀虫基因分成六大类六大类,统称为统称为Cry基因基因,用罗马数字用罗马数字，等来命名等来命名,分别代表几种杀虫范围。分别代表几种杀虫范围。 在烟草中进行了在在烟草中进行了在后代中删除后代中删除Bt基基因的实验，因的实验， PCR鉴定证明转基因烟鉴定证明转基因烟草后代中草后代中Bt基因基因已被删除。已被删除。 对转基因烟草进行对转基因烟草进行了生物抗虫性试验，了生

26、物抗虫性试验，结果显示结果显示,未含有未含有Bt基因的烟草棉铃基因的烟草棉铃虫不会被杀死，而虫不会被杀死，而含有含有Bt基因的烟草基因的烟草则毒杀了棉铃虫。则毒杀了棉铃虫。由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。 1.1.2 其他来源于微生物的抗虫基因其他来源于微生物的抗虫基因 来源于根癌农杆菌的来源于根癌农杆菌的异戊烯转移酶异戊烯转移酶(IPT)基基因因编码细胞分裂素生物合成途径中的一个编码细胞分裂素生物合成途径中的一个关键酶关键酶,在烟草，番茄中表达后在

27、烟草，番茄中表达后,可减少烟草可减少烟草夜蛾对叶片的损伤夜蛾对叶片的损伤,并降低桃蚜的生存力。并降低桃蚜的生存力。 胆固醇对细胞膜的完整性和功能是必需的。胆固醇对细胞膜的完整性和功能是必需的。来源于链霉菌类的来源于链霉菌类的胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶对棉铃象对棉铃象甲幼虫有极高的毒性甲幼虫有极高的毒性,并能延缓美洲烟草夜并能延缓美洲烟草夜蛾的生长。蛾的生长。 目前目前,从高等植物获得的抗虫物质主要有两从高等植物获得的抗虫物质主要有两大类大类: 一类是一类是动物消化酶的抑制剂动物消化酶的抑制剂(包括蛋白酶抑包括蛋白酶抑制剂和淀粉酶抑制剂制剂和淀粉酶抑制剂); 另一类是另一类是植物凝集素植物凝集素。

28、 1.2.1 蛋白酶抑制剂类抗虫基因蛋白酶抑制剂类抗虫基因 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(PI)基因表达基因表达的蛋白酶抑制剂是的蛋白酶抑制剂是一类存在于许多植物的贮藏器官一类存在于许多植物的贮藏器官(如种子和块茎如种子和块茎中中)的蛋白质的蛋白质,最早发现于最早发现于1938年年,其含量高达总其含量高达总蛋白的蛋白的1%10%。昆虫体内的蛋白酶负责食物。昆虫体内的蛋白酶负责食物中蛋白质的消化中蛋白质的消化,将蛋白酶抑制剂基因引入植物将蛋白酶抑制剂基因引入植物,即可通过影响昆虫的消化作用而致昆虫死亡即可通过影响昆虫的消化作用而致昆虫死亡 。 优点：具有抗虫谱广，对人畜无副作用及昆虫优点：具有抗虫谱

29、广，对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等，是一类天然的抗虫物质。不易产生耐受性等，是一类天然的抗虫物质。 1.2.2 植物凝集素基因植物凝集素基因 外源凝集素基因是一类糖结合蛋白外源凝集素基因是一类糖结合蛋白,在自然在自然界中分布十分广泛界中分布十分广泛,是植物防御系统的一个是植物防御系统的一个组成部分。组成部分。 凝集素抗虫的作用机制可能是在昆虫肠腔凝集素抗虫的作用机制可能是在昆虫肠腔部位与糖蛋白结合部位与糖蛋白结合,降低膜透性降低膜透性,从而影响营从而影响营养物质的正常吸收养物质的正常吸收,同时诱发病灶同时诱发病灶,促进消化促进消化道内细菌繁殖道内细菌繁殖,使昆虫得病或引起拒食，生使昆虫得

30、病或引起拒食，生长停滞甚至死亡长停滞甚至死亡 动物来源的抗虫基因主要有动物来源的抗虫基因主要有4类类,一是丝氨酸一是丝氨酸(Ser)蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因,二是昆虫毒素基因二是昆虫毒素基因,三是几丁三是几丁质酶基因质酶基因,四是体激素基因。四是体激素基因。 现在人们发现现在人们发现,来源于哺乳动物和烟草夜蛾的来源于哺乳动物和烟草夜蛾的Ser蛋白酶抑制剂是很有发展前景的抗虫蛋白。而来蛋白酶抑制剂是很有发展前景的抗虫蛋白。而来源于蝎子，蜘蛛，胡蜂，蚂蚁等捕食性动物的昆源于蝎子，蜘蛛，胡蜂，蚂蚁等捕食性动物的昆虫毒素基因编码的蛋白分子量小虫毒素基因编码的蛋白分子量小,这些毒素一般都这些毒素

31、一般都能专一性作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很能专一性作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小小,这些毒素基因也已开始应用于基因工程这些毒素基因也已开始应用于基因工程 。 利用基因工程改善棉纤维的方法主要有两种基本途利用基因工程改善棉纤维的方法主要有两种基本途径：径： 一是增加或减少与某些棉纤维品质相关的蛋白质或酶的一是增加或减少与某些棉纤维品质相关的蛋白质或酶的表达水平。这一途径需要分离鉴定出与棉纤维相关的基表达水平。这一途径需要分离鉴定出与棉纤维相关的基因。目前的工作主要是试图分离鉴定那些仅在或主要在因。目前的工作主要是试图分离鉴定那些仅在或主要在纤维细胞内表达基因。一般认为在纤维细胞内特意

32、表达纤维细胞内表达基因。一般认为在纤维细胞内特意表达的基因可能对纤维发育起重要作用。的基因可能对纤维发育起重要作用。 二。从其他生物中选择有潜力的基因，将其导入棉花，二。从其他生物中选择有潜力的基因，将其导入棉花，以提高棉纤维品质。例如以提高棉纤维品质。例如PHB（聚羟基丁酸）是理化性（聚羟基丁酸）是理化性质类似聚丙烯的天然可降解的热塑性化合物，许多细菌质类似聚丙烯的天然可降解的热塑性化合物，许多细菌可产生该物质，由于其天然可降解，所以不会产生污染。可产生该物质，由于其天然可降解，所以不会产生污染。研究表明转基因棉花纤维在弹性和强度上发生有益变化。研究表明转基因棉花纤维在弹性和强度上发生有益变

33、化。 无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程首要考虑的问题就是首要考虑的问题就是提高其表达量提高其表达量。一般。一般来说来说,表达量越高表达量越高,抗虫效果就越好。抗虫效果就越好。 导入的抗虫基因翻译水平不高是普遍存在导入的抗虫基因翻译水平不高是普遍存在的问题的问题,因此因此,如何提高外源抗虫基因在植物如何提高外源抗虫基因在植物体内的表达体内的表达,是植物抗虫基因工程的一个重是植物抗虫基因工程的一个重要研究方向。为此要研究方向。为此,科研工作者已尝试从几科研工作者已尝试从几条途径来提高抗虫基因的表达。条途径来提高抗虫基因的表达。 1 .对非必需区段进行缺失处理

34、对非必需区段进行缺失处理 2 .基因改造基因改造 3 .利用定位信号提高基因表达利用定位信号提高基因表达 4 .利用基质结合区提高基因表达利用基质结合区提高基因表达 5 .叶绿体转化叶绿体转化 6 .改进改进Ti质粒转化载体的启动子质粒转化载体的启动子 Bt基因含有较多的基因含有较多的AT碱基和碱基和ATTTA重复序列。重复序列。AT富含富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子区在高等植物中被认为是不能表达的内含子,ATTTA重重复序列的复序列的mRNA的稳定性差的稳定性差,二者都不能在高等植物中二者都不能在高等植物中编码。此外编码。此外,Bt基因中的偏爱密码子与植物中的不同基因中的偏爱密码

35、子与植物中的不同,以以及其中存在的一些不稳定元件如及其中存在的一些不稳定元件如poly(A)信号序列、切信号序列、切割序列、终止序列等都直接影响着割序列、终止序列等都直接影响着Bt基因在植物中的基因在植物中的mRNA特性。特性。 为此为此, 从两条途径对原基因进行了改造。从两条途径对原基因进行了改造。 第一条途径是改进第一条途径是改进Ti质粒转化载体的启动子质粒转化载体的启动子,加入加入带有带有SV40复制增强子区的复制增强子区的35S启动子或重复的强化表启动子或重复的强化表达区达区(duplicated enhanced region),发现改建后的载发现改建后的载体表达量比原先提高了体表达

36、量比原先提高了510倍。倍。 第二条途径是根据植物偏爱的密码子对野生型第二条途径是根据植物偏爱的密码子对野生型(WT)Bt基因基因cryA(b)进行部分改造或人工全合成进行部分改造或人工全合成 。 Perlak等对等对WTcryA(b)（野生型）的（野生型）的AT富含区进富含区进行点突变行点突变,改变其中改变其中63个碱基对个碱基对,AT含量由含量由63%下降下降至至59%,而而ATTTA重复序列也从重复序列也从13个减少至个减少至7个个,部分部分改造后的基因称为改造后的基因称为PM cryA(b)。PM cryA(b)基因在转化的烟草和番茄中的表达量为基因在转化的烟草和番茄中的表达量为110

37、ng/50g植物可溶总蛋白植物可溶总蛋白,比比WTcryA(b)在转在转基因植物中的表达量基因植物中的表达量(lng/50g)提高了提高了10倍。倍。 进一步在不改变编码的氨基酸序列的前提下进一步在不改变编码的氨基酸序列的前提下,几乎更几乎更换掉换掉WT基因中的所有不稳定元件基因中的所有不稳定元件,同时尽可能将其同时尽可能将其中的密码子换成植物优化密码子中的密码子换成植物优化密码子,AT含量下降至含量下降至51%,去掉所有去掉所有ATTTA序列。全合成的基因称为序列。全合成的基因称为FM cryA(b)，用其转化烟草和番茄，用其转化烟草和番茄,10%以上的转化以上的转化植株表达量达植株表达量达

38、30100ng50g植物可溶总蛋白植物可溶总蛋白,最高最高的可达的可达100150ng50g,比比WT cryA(b)的表达量的表达量提高提高50100倍倍,表现较强的杀虫效果。表现较强的杀虫效果。 目前目前,转抗虫基因植物的研究已取得很大进转抗虫基因植物的研究已取得很大进展展, 并在生产上展现出了良好的应用前景。并在生产上展现出了良好的应用前景。 但转基因的抗虫植物在应用中的潜在问题但转基因的抗虫植物在应用中的潜在问题也日益凸显也日益凸显,主要有杀虫蛋白主要有杀虫蛋白基因基因在植物体在植物体内的内的沉默沉默;昆虫对杀虫蛋白昆虫对杀虫蛋白产生抗性产生抗性;转抗虫转抗虫基因植物存在潜在的基因植物

39、存在潜在的生态风险性生态风险性等。等。 3.1 抗虫基因的基因沉默抗虫基因的基因沉默 目前目前,已发现基因沉默与转基因在受体植物中已发现基因沉默与转基因在受体植物中甲基化甲基化状况，转基因的状况，转基因的拷贝数拷贝数，插入插入受体植物染色体受体植物染色体位点位点及转基因及转基因是否是否与受体植物与受体植物存在同源基因存在同源基因等因素有关。等因素有关。 减少基因沉默的主要对策有减少基因沉默的主要对策有:基因改造基因改造,降低其与寄主降低其与寄主基因的同源性基因的同源性;采用低拷贝数采用低拷贝数(最好是单拷贝最好是单拷贝)的载体的载体;利用植物基因中相应的增强子利用植物基因中相应的增强子,构建嵌

40、合基因构建嵌合基因;用叶绿用叶绿体转化体转化;利用基质结合区利用基质结合区(Matrix attachment region,MAR)增强外源基因表达稳定性增强外源基因表达稳定性;在载体上加在载体上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化上有去甲基化功能的序列以防止甲基化 。 3.2 抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题 害虫的抗性是指害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低了对某一个种群在遗传基础上降低了对某一种杀虫剂的敏感性一种杀虫剂的敏感性。虽然昆虫对转基因植物的抗。虽然昆虫对转基因植物的抗性发展缓慢性发展缓慢,但也是一个不容忽视的问题。转基因植但也是一个不容忽视的问题

41、。转基因植物的大田抗性试验证明物的大田抗性试验证明,经经12次繁殖后昆虫便对次繁殖后昆虫便对Bt毒蛋白产生抗性毒蛋白产生抗性,转单一转单一ICP基因的植物在生产上一基因的植物在生产上一般只能用般只能用810年。年。 由此看来由此看来,昆虫的抗性是抗虫转基因工程中较为严重昆虫的抗性是抗虫转基因工程中较为严重的潜在问题的潜在问题,因此如何防止或延缓害虫产生抗性因此如何防止或延缓害虫产生抗性,这这已经成为植物抗虫基因工程的另一重要研究内容。已经成为植物抗虫基因工程的另一重要研究内容。 3.3 转抗虫基因植物潜在的生态风险性转抗虫基因植物潜在的生态风险性 转抗虫基因植物的安全性是一个长期，重要而且转抗

42、虫基因植物的安全性是一个长期，重要而且复杂的问题复杂的问题,应谨慎对待。抗虫转基因植物的直接应谨慎对待。抗虫转基因植物的直接生态效应是对靶标昆虫种群的控制生态效应是对靶标昆虫种群的控制,但靶标昆虫有但靶标昆虫有无向其他寄主植物转移的可能无向其他寄主植物转移的可能;害虫天敌种群会受害虫天敌种群会受到怎样的影响到怎样的影响;次要害虫是否会变为主要害虫次要害虫是否会变为主要害虫;靠靠转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基因抗转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基因抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都是需进一步研究的问题。是需进一步研究的问题。 指通过

43、微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型指通过微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型化学分析系统化学分析系统,从而实现对细胞、蛋白质、从而实现对细胞、蛋白质、DNA以以及其他生物组分的准确快速与大信息量的检测。及其他生物组分的准确快速与大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类常用的生物芯片分为三大类: 1 基因芯片基因芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray) 2 蛋白质芯片蛋白质芯片(Proteinchip) 3芯片实验室芯片实验室(Lab-on-a-chip) 又称又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前应用最广泛的微阵

44、列芯片。它是指在固相也是目前应用最广泛的微阵列芯片。它是指在固相载体上按照特定的排列方式固定上大量的载体上按照特定的排列方式固定上大量的 DNA片片断，形成断，形成DNA微矩阵。将样品基因组微矩阵。将样品基因组DNA/RNA通通过体外逆转录，过体外逆转录，PCR/RT-PCR扩增等技术掺入标记扩增等技术掺入标记分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量

45、基因序列特征或基因表析后，即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。达特征信息。 基因芯片检测的最一般原理仍然是基于碱基互补基因芯片检测的最一般原理仍然是基于碱基互补的核酸分子杂交，相对与的核酸分子杂交，相对与Southern印记法印记法 ，Northern印记法而言，基因芯片是一种反向杂交印记法而言，基因芯片是一种反向杂交技术，把大量的技术，把大量的 已知序列的基因探针有序的固定已知序列的基因探针有序的固定到固相介质上，这样每个点实际上就代表了某个到固相介质上，这样每个点实际上就代表了某个特定的基因，然后把样品中的靶基因特定的基因，然后把样品中的靶基因（DNA/RNA/MRNA)进行

46、标记，与基因进行常规进行标记，与基因进行常规的分子杂交，从而对基因序列及功能进行大规模，的分子杂交，从而对基因序列及功能进行大规模，高通量的研究。高通量的研究。 芯片种类较多，制备方法也不尽相同，常芯片种类较多，制备方法也不尽相同，常见的芯片可分为两大类：见的芯片可分为两大类： 1.原位合成法原位合成法 2.直接点样法直接点样法 原位合成适用于寡核苷酸原位合成适用于寡核苷酸.原位合成有两种原位合成有两种途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。光蚀途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。光蚀刻法可以合成刻法可以合成30nt左右，喷印法可以合成左右，喷印法可以合成40-50nt，光蚀刻法每步缩合率较低，一般，光蚀

47、刻法每步缩合率较低，一般为为95%左右，合成左右，合成30nt产率仅产率仅20%；喷印；喷印法可达法可达99%以上，合成以上，合成30nt产率可达产率可达74%，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外，喷印法不需特殊的合成试剂。高。此外，喷印法不需特殊的合成试剂。 点样法是将合成好的探针、点样法是将合成好的探针、cNDA或基因组或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者样分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学采用

48、人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的的DNA芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时费力，不适于大规模费力，不适于大规模DNA芯片制作，因而实现自芯片制作，因而实现自动化点样就显得尤为重要。动化点样就显得尤为重要。 （一）基因表达分析基因芯片具有高度的敏感性（一）基因表达分析基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情

49、况拷贝的转录情况 （二）基因型、基因突变和多态性分析（二）基因型、基因突变和多态性分析 在同一物在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。用基因芯片可以同时反应数千甚至更多个基关系。用基因芯片可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性因的特性，我

50、们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。状或疾病的关系。 （三）疾病的诊断与治疗人类的疾病与遗传（三）疾病的诊断与治疗人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的，就临床一种新的、强有的优势是不言而喻的，就临床一种新的、强有力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。（四）药物研究中的应用（四）药物研究中的应用从经济效益来说，最

51、大的应用领域可能是制药厂用来从经济效益来说，最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如：如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。等。对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。采用所谓水平上寻找药物靶标。采用所谓“译码器译码器”策略策略（Decoder strategy）来确定药物靶标。从而找到）来确定药物靶标。从而找到“导向药物导向药物”。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物。细菌或肿瘤组织的耐药性也涉及基因改变可以用物。细菌或肿瘤组织的耐药性也涉及基因改变可以用DNA芯片鉴定。芯片鉴定。 1 新药开发高通量的新药开发高通量