疫苗佐剂CpGODN的研究进展

1、疫苗佐剂CpG ODN的研究进展摘要： CpG ODN 是指含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列，人工合成的 CpG ODN 是根据细菌 DNA 的结构特性及免疫特性而定的。 CpG ODN 通过 TLR9可以直接激活B 细胞和树突细胞引起直接的 Th1 型免疫反应。 CpG ODN 因其可以提高疫苗的反应速度，增强疫苗的反应强度以及免疫耐受力而被认为是一种有效的佐剂。例如 CpGODN 联合 OVA 免疫可以明显的提高AVA 的抗感染能力。 CpG ODN 联合多种疫苗均可以增强相应的体液免疫和细胞免疫， 同时增强灵长类和啮齿类对病毒的抵抗能力。 临床试验证明CpG O

2、DN 是一种对人类安全有效的佐剂，可以增强对疫苗的特异性反应。关键词：CpG ODN作用机制；佐剂；黏膜佐剂Abstract ： Synthetic oligodeoxynucleotides (ODN) containing unmethylated CpG motifs mimic the immunostimulatory activity of bacterial DNA. CpGODN directly stimulate B cells and plasmacytoid dendritic cells (pDC),promote the production of Th1 immu

3、ne responses through Toll-like receptor 9. CpG ODN are ?nding use as vaccine adjuvants,where they increase the speed,magnitude and duration of vaccine-speci?c immune responses. For example, CpG ODN significantly prolong the protection induced by AVA (Anthrax Vaccine Adsorbed). Co-administering CpG O

4、DN with a variety of vaccines has improved the resultant humoral and/or cellular immune responses, culminating in enhanced protective immunity in rodent and primate challenge models. Ongoing clinical studies indicate that CpG ODN are safe and well-tolerated when administered as adjuvants to humans,

5、and that they can support increased vaccinespeci?c immune responses.Key Words ： CpG oligodeoxynucleotides； Mechanism ； Adjuvant ； Mucosal adjuvant免疫佐剂概念最早在 1924 年由 Ramon 提出， 至今已有近百年的深入研究， 但是临床应用的疫苗佐剂还仅限于几种如弗氏佐剂， 铝佐剂等， 人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂。 新型 佐剂的开发利用已成为现代疫苗研究中一个非常重要的领域。CpG ODN 是指具有免疫刺激作用的含非甲基化的 CpG 寡居核苷酸的

6、 DNA 序列。 1984年， Tokunaga 等人 1 首次发现结核分枝杆菌的 DNA 除了是一种遗传物质外， 还具有抗肿瘤特性。 1995 年， Krieg 等人 2 证实这些 DNA 中含有的非甲基化的 CpG 基序是与其免疫激特性密切相关的结构。随后， Tokunaga 等人通过研究发现：以未甲基化 CG 二聚核苷酸为核心的特定核苷酸序列是DNA 具有免疫学活性的重要特性，免疫系统通过对这些特定序列的识别来诱发免疫应答。 Krieg 等人认为使CpG 具有强的免疫刺激作用的充要条件： ( 1) 碱基数目不能少于8 个，否者不能引起免疫刺激。 (2)CpG 核心序列的两侧需要2 个 5

7、 ， 嘌呤和2 个 3， 嘧啶，且当 5 端为 GpA 、 3，端为TpC 或 TpT 时活性最强。 (3)硫代磷酸酯修饰后的 CpG ， 因增强了 CpG ODN 抗核酸酶降解的能力， 延长了其半衰期， 而相应的增强其免疫活性。 CpG ODN 既存在于细菌病毒等原核生物中，又存在于脊椎动物中。但是该序列在病毒和原核生物基因组中出现的频率远高于脊椎动物，且脊椎动物中60%-90% 的胞嘧啶通常是甲基化的， 这种差异使脊椎动物的免疫系统把未甲基化的 CpG ODN 作为一种免疫原， 并 通过特定受体诱导增强免疫反应。 本文就 CpG ODN 的作用机制以及其作为佐剂增强系统免疫和黏膜免疫的研究

8、进展做一简单综述。1、CpG ODN勺生化特征及其作用机制 CpG ODN 是由含未甲基化的 CpG 二核苷酸为核心的回形序列组成，其基本骨架为 5 -PuPuCGPyPy-3 。2 CpG ODN 的结构和分类通常CpG ODN的每一条DNA单链具有24个CpG双核甘酸，每条主链有两种磷酸化的 修饰方式：磷硫酰 (phosphorothioate , PTO)主链或磷酸二酯(phosphodiester, PO)主链。每种 CpG ODN 的结构和免疫激活作用均不同。根据CpG ODN 的结构及其对不同免疫细胞的激活作用， 可将 CpG ODN 分为 3 类。 abc (1)A 型 CpG

9、ODN(A-Class CpG ODN ， CpG-A ODN) 也称D型CpG ODN :在ODN的3'和5'末端主要由PO主链及PTO多聚G序歹肺成。CpG-A ODN可以刺激浆细胞样树突状细胞产生大量”干扰素进而激活 NK细胞并引起丫干扰素的分泌。 但 CpG-A ODN 对刺激 B 细胞活化的作用较弱。 (2)B 型 CpG ODN(B-Class CpG ODN ， CpG-B ODN) 也称 K 型 CpG ODN ： CpG-B ODN 完全由 PTO 主链构成，有很强的刺激B 细胞活化的作用但刺激浆细胞样树突状细胞产生a干扰素的作用较弱。 (3)C型CpGODN

10、(C-Class CpG ODN ， CpG-C ODN) ： CpG-C ODN 也完全由 PTO 主链构成， 兼具 CpG-A ODN 和 CpG-B ODN 的作用。 Kanellos 等4通过研究发现脊椎动物免疫识别系统对 CpG 基 序的识别有一定的差异。通过改变化学结构和碱基等，人工合成的 CpG ODN 结合了三种 类型的优点,同时客服了种属间的差异。免疫应答的过程即病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern， PAMP) 与天然免疫细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)相结合，

11、从而激活免疫应答的过程。细菌 CpG ODN 便是一个 PAMP ，其受体是PRR 中的一种 Toll 样受体 9(TLR9) 。TLR9 存在于 B 细胞，巨噬细胞等免疫细胞的内质网内表面中，但是T 细胞中不存在这种TLR9。因此，CpG ODN可以引起直接的 Th1型免疫反应，通过细胞因子，IFNa等可以引起间接的 Th2 型免疫反应。2、CpG ODNI高抗原的免疫原性2.1 CpG ODN 提高蛋白的免疫原性Klinman 5等通过研究表明以CpG ODN 作为佐剂提高蛋白抗原（如卵清蛋白）的免疫原性约 3 倍。 当用 OVA 和 CpG ODN 免疫时， 因其固着时间短免疫力低。 联

12、合 OVA 和 CpGODN 在不完全弗氏佐剂中孵化后免疫 IgG 提高了 10 倍。通过生物素蛋白或化学桥梁交联OVA和CpG ODN也可明显的提高其免疫原性，而将交联的混合物通过DN A消化酶后其免疫原性即消除。另外将CpG ODN 的核心序列替换后和OVA 交联后其免疫原性亦消除。说明 CPG 具有很强的佐剂作用。通过不同的实验证明 CpG ODN 具有疫苗佐剂的作用。 H xie,I.Gursel 6-7等将脂质体作为免疫载体把CpG ODN 和抗原一同包裹于重组的微体中，免疫后直接与抗原呈递细胞反应，引起高水平的 CTL 8 。 CpG ODN 和抗原结合后可以提高免疫原的作用时间和

13、强度，因 此可以提高免疫效率。2.2 CpG ODN 对同源抗体的作用Klinman 5等通过研究表明CpG ODN 可以引起 IgG 抗体的 IgG1 和 IgG2a 之间的转换。加入 CpG ODN 后 IgG1 ： IgG2a 的比例由原来的 7:1 变为 2.8:1 。 产生 IgG2a 抗体的免疫反应增强。不同的抗原如肝炎B 表面抗原、流感病毒、破伤风病毒、麻疹病毒、布鲁氏菌、天花的 L1 和 A33 蛋白、联合CpG ODN 均可以改变IgG1 和 IgG2a 抗体滴度的比例 9 。2.3 CPG ODN对抗原特异性细胞因子产生的影响Klinman 5等人通过研究 OVA和CpG

14、ODN的联合作用对抗原特异性细胞因子IFN 丫的作用。发现CPG ODN和OVA共免在动物体内产生的IFN 丫比单独用OVA免疫高两倍，并 且和CpG ODN的量呈剂量效应。用不含 CpG核心序列的 CpG ODN和OVA共免后IFN 丫 无变化。此外， CpG ODN 能刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（ DC ） NK 细胞，活化 表达IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF、IFN ”等细胞因子。表现为直接的Th1型，并在Th1细胞的协同作用下激活细胞毒 T 淋巴细胞表现为强烈的细胞免疫反应10 。3、CpG ODN乍为佐齐【J的应用状况因其独特而强烈的免疫激活作用， CpG

15、ODN 作为免疫佐剂及免疫治疗药物的研究取得 了多方面进展。3.1 CpG ODN 作为疫苗佐剂增强系统免疫反应CpG ODN 作为疫苗的佐剂明显的提高系统的细胞免疫和体液免疫，与疫苗共同作用即 可以提高以Th1型反应为主的预防治疗，又因其可以提高CTL,激活细胞因子引起一系列的级联反应而提高多种疾病的预防。Mendez11等人将CpG ODN作为佐剂同利什曼原虫病毒共同免疫小鼠后，免疫系统产生的 CD4+、 CD8+、 IFNs 、 T 细胞升高 2-3 倍，使利什曼原虫在宿主体内蔓延扩散的能力下降了1000多倍。Dennis9等人用人的炭疽疫苗（AVA）作为免疫原来免疫小鼠，单独使用 AV

16、A 免疫时可以产生IgG、 AVA 抗体并能提高巨噬细胞的杀伤能力 ; 当 CpG ODN 作为 AVA 的佐剂共同免疫小鼠时其抗体水平比单独用 AVA 时提高了8-100倍。而且通过实验发现在恒河猴体内也有这样的作用。H. xie6等人将CpG ODN与脂质体通过化学方法连接成微体后作为佐剂与AVA 共同免疫小鼠后，其抗体的水平比单独的用 CpG ODN 作为佐剂免疫小鼠后的水平高8-30 倍。 通过以上研究表明 CpG ODN 可以增强系统的免疫反应，当 CpG ODN 与脂质体共同作为佐剂时效果更好。疫苗主要是用来预防病原物质对宿主的危害， 能否及时的对病原物做出应答也是衡量疫苗的有效性

17、的重要指标。 Klinman 12等人用 CPG ODN 作为佐剂与AVA 共免后 5、 10、 15 天进行攻毒实验，与AVA 组和对照组进行比较后发现： CPG ODN 作为佐剂与AVA 共免组其抗体水平存活率均明显高于其他组，第 10 天攻毒后 CpG ODN+A VA 组抗体水平比 AVA 组高 10 倍。 虽然在第 5 天抗体水平差别不大， 但是其存活率存在显著性差异。 说明 CpG ODN 可以加快宿主对病原物质的防御作用。3.2 CpG ODN 作为疫苗佐剂增强黏膜免疫反应机体约有80以上的细菌、病毒和寄生虫的感染都起始于粘膜表面。因此黏膜免疫的预防接种技术是一种重要的预防和治疗

18、疾病的途径。 Moldoveanu 13等以CpG ODN 作为灭活流感病毒的抗体，测得血清IgG 和鼻腔、生殖道IgA 的抗体滴度比单独的灭活流感病毒抗原组显著增高，第一次证明 CpG ODN 具有黏膜佐剂作用。 Dennis9 等以 CpG ODN 作为佐剂，AVA、3-牛乳糖等其他黏膜免疫原共同免疫实验动物，测得 IgG和IgA的滴度均高于未加佐剂组，证明 CpG ODN是一种有效的黏膜佐剂。Tengvall14等以抗原HSV-2联合CpGODN 共同阴道免疫动物，可以通过提高黏膜免疫和 Th1 型免疫，来提高动物抗 HSV-2 感染能力。Prince15 等用CpG ODN 联合抗原R

19、SV 的 F 蛋白共同鼻内免疫小鼠， 通过呼吸道洗脱液测得比单独抗原组显著增高的 IgA 滴度，同时MHC 限制性分子，抗原特异性CTL 的数量， 以及鼻内攻毒的抵抗能力均有显著性提高。 Harandi, 16 Raghavan17 等分别用生殖疱疹病毒、 幽门螺杆菌病毒联合 CpG ODN 共免小鼠雌性小鼠的鼻腔、 肠道以及阴道用来研究CpGODN 对不同黏膜组织的作用，通过各个组织的趋化因子发现，最早在阴道内免疫产生CC型趋化因子 RANTES, MIP- 1 a , MIP-1 &以及CXC型趋化因子 MIP-2和IP-10且数目明显 增高数倍，阴道内 B 细胞、 NK 细胞、

20、NKT 细胞以及 T 细胞数目明显升高。肠胃免疫同样会提高 CC 型趋化因子和CXC 型趋化因子的数目。鼻内免疫可以提高CC 型趋化因子的数目，随后提高相应的免疫反应。通过此研究表明 CpG ODN 可以引起全身的黏膜组织反应，根据病原菌的感染途径，选择合适的免疫途径，可以提高反应时间和效率。可见，针对多种黏膜免疫途径CpG ODN 均具备良好的黏膜佐剂作用。3.3 CpG ODN 的其他应用现状新生的动物免疫系统易对外源物质产生免疫耐受性， 导致无法产生免疫反应。 Brazolot 18等基于 CpG ODN 对成年鼠的佐剂作用，研究了 CpG ODN 对新生鼠的佐剂作用。通过研究发现 Cp

21、G ODN 联合抗原可以提高新生鼠的抗体滴度，以及CTL 反应。 S. Ito 19等通过研究发现 CpG ODN 联合李斯特菌抗原共勉后可以提高怀孕母鼠的产仔率。说明 CpG ODN 作为佐剂的安全性以及有效性。当年龄增大， 疾病侵袭或免疫治疗时免疫力会有所下降。 通过联合 CpG ODN 与抗原共同免疫老龄鼠，或免疫机制受损的年青老鼠发现， CpG ODN 可以明显的改善其免疫机制，提高免疫效率。对CpG ODN 的研究不仅限于小鼠，家禽，水禽与人类血缘关系相近的其他灵长类生物也都证明了 CpG ODN 不仅能够提高体液免疫和细胞免疫， 更能够提高黏膜免疫反应 9 。据报道三种抗原联合 C

22、pG ODN被用于人的临床实验。Fluarix流感疫苗、Engerix-B （肝炎疫苗）和AVA 20-22 作为抗原，联合 CpG ODN 作为免疫原，身体健康无病毒携带者的志愿者作为免疫对象，综合免疫后的各种指标证明， CpG ODN 是一种可以用于人类临床应用的佐剂。 CpG ODN 联合 CTB 、 mLT63 、纳米微核等其它物质作为佐剂也有报道，并有良好的效果。4、综述与其他佐剂相比较， CpG ODN 具有以下优点： CpG ODN 不仅可以增强系统免疫还能增强黏膜免疫； CpG ODN 可以通过人工合成的方法获得，生产成本低； CpG ODN 全链经过硫代硫酸化修饰后其半衰期长

23、，佐剂效果明显提高； CpG ODN 可以通过多种途径免疫如口腔、鼻腔、阴道、皮下注射、肌肉注射等。 CpG ODN 能与多种形式的疫苗共免，且可以和多种免疫佐剂或免疫载体作为联合佐剂。 CpG ODN 在动物研究中， 治疗剂量内安全性高，耐受性好。 但是有关研究报道高剂量的 CpG ODN 具有潜在的毒性， 因此在用于人类临床应用时应慎重。但是，随着研究的不断深入以及免疫学，分子生物学、实验技术的不断发展。相信在不久的将来CpG ODN 会成为人类疫苗的重要佐剂。参考文献：1Tokunaga, T; Yamamoto, H; Shimada, S; Abe, H; Fukuda, T; Fu

24、jisawa, Y; Furutani, Y; Yano, O et al . (1984). "Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity". Journal of the National Cancer Institute 72 (4): 955 -9622 Krieg, AM; Yi, AK; Matson,

25、 S; Waldschmidt, TJ; Bishop, GA; Teasdale, R; Koretzky, GA;Klinman, DM (1995). "CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation". Nature 374 (6522): 546 549awilson HL,Dar A ， Napper SK ， et a1 Immune mechanisms and therapeutic potential of CpG oligodeoxynucleotidesJ Int Rev Im

26、munol,2006 ， 25(3-4 ) ： 183 213 bKrieg AM Therapeutic potential of Toll like receptor 9 activation Nat Rev Drug Discov JT-Nature reviews J Drug D,2006， 5( 6) ： 471-484CKlinman DM Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucleotides J Int Rev Immunol ，2006， 25(3-4) ： 135-l54 4Krug A, Rothenfusser S,Hornung

27、 V .et al.Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells.Eur J Immunol,2001,31(7):2154-21635D.M. Klinman, K.M. Barnhart, J. Conover, CpG motifs as immune adjuvants, Vaccine 17 (1999) 19N5.6 H. xie, I. Gursel, B.E. Ivins, M. Singh

28、, D.T. O'Hagan, J.B. Ulmer, et al., CpG oligodeoxynucleotides adsorbed onto polylactide-co-glycolide microparticles improve the immunogenicity and protective activity of the licensed anthrax vaccine, Infect. Immun. 73 (2005) 828 -833.7 S. Adams, T. Zordan, K. Sainis, S.K. Datta, T cell receptor

29、V beta genes expressed by IgG anti-DNA autoantibody-inducing T cells in lupus nephritis: forbidden receptors and double negative T cells, Eur. J. Immunol. 20 (1990) 1435 -1443.8 D.M. Klinman, Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucleotides7, Int. Rev. Immunol. 25 (2006) 135 -154.9 Dennis M. Klinman ,

30、 Sven Klaschik, Takashi Sato, Debbie Tross. CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases, Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 248 t25510范媛，谢光武，黎晓敏 兔疫佐剂CpG-DNA的研究进展J.中自动物保健.2009(10)44-49.11 S. Mendez, K. Tabbara, Y . Belkaid, S. Bertholet, D. Verthelyi, D. Klinman

31、, et al.,Coinjection with CpG-containing immunostimulatory oligodeoxynucleotides reduces the pathogenicity of a live vaccine against cutaneous Leishmaniasis but maintains its potency and durability, Infect. Immun. 71 (2003) 5121 -512912D.M. Klinman, D. Currie, G . Lee, V. Grippe, T. Merkel, Systemic

32、 but not mucosal immunity induced by A VA prevents inhalational anthrax1, Microbes Infect. 9 (2007) 1478 T48313 Z.Moldoveanu, L. Love-Homan,W.Q. Huang, A.M. Krieg, CpG DNA, a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunizationwith in?uenza virus. Vaccine 16 (1998) 1216 T224.14S. Tengvall, A.

33、 Lundqvist, R.J. Eisenberg, G .H. Cohen, A.M. Harandi, Mucosal administration of CpG oligodeoxynucleotide elicits strong CC and CXC chemokine responses in the vagina and serves as a potent Th1-tilting adjuvant for recombinantgD2 protein vaccination against genital herpes, J. Virol. 80 (2006) 5283 右2

34、91.15G.A. Prince, J.J. Mond, D.D. Porter, K.C. Yim, S.J. Lan, D.M. Klinman, Immunoprotective activity and safety of a respiratory syncytial virus vaccine:mucosal delivery of fusion glycoproteinwith a CpG oligodeoxynucleotide adjuvant, J. Virol. 77 (2003)13156 T3160.16Harandi AM, Eriksson K, Holmgren

35、 J. A protective role of locally administered immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in a mouse model of genital herpes infection. J Virol 2003;77:953 £2.17 Raghavan S, Fredriksson M, Nystr "om J, Holmgren J, Harandi AM.Orally administered CpG oligodeoxynucleotide induces production of CXC and CC chemokines in the gastric mucosa and suppresses bacterial colonization in a mouse model of Hel