人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

1、Journal of Tropical Medicine Vol.7No.7Jul.2007层 粘 连 蛋 白 (laminin , LN 是 细 胞 外 间 质 成 份 中 的 一 种 非 胶 原 性 糖 蛋 白 , 主 要 存 在 于 基 底 膜 的 透 明 层 , 与 型 胶 原 等 共 同 维 持 基 底 膜 的 结 构 和 功 能 。 自 1979年 首 次 分 离 并 命 名 以 来 1, 已 相 继 发 现 LN 与 某 些 疾 病 密 切 相 关 , 测 定 血 清 层 粘 连 蛋 白 在 肝 纤 维 化 诊 断 2, 3、 门 静 脉 高 压 判 断 4及 肿 瘤 侵 润 5

2、等 方 面 具 有 重 要 临 床 价 值 。本 研 究 旨 在 研 究 制 备 抗 人 层 粘 连 蛋 白 单 克 隆 抗 体 (McAb , 为 建 立 检 测 人 层 粘 连 蛋 白 的 免 疫 学 试 剂 盒 奠 定 基 础 。1材料与方法1.1材 料 1.1.1细 胞 Sp2/0骨 髓 瘤 细 胞 由 本 室 冻 存 , 培 养 于 含 10%灭 活 小 牛 血 清 的 RPM1640培 养 液 中 。 1.1.2动 物Balb /C 小 鼠 购 自 中 山 大 学 动 物 中 心 , 雄 性 ,7周 龄 , 级 , 体 重 约 20g 。 1.1.3抗 原人 层 粘 连 蛋 白 由

3、 本 室 从 人 胎 盘 经 胃 蛋 白 酶消 化 提 取 , 免 疫 层 析 纯 化 。1.1.4主 要 试 剂 及 仪 器RPMI-1640、 HAT 培 养 液 和 HT培 养 液 (美 国 Gibco 公 司 ; 小 牛 血 清 (美 国 Hyclone 公 司 ; 弗 氏 完 全 佐 剂 及 弗 氏 不 完 全 佐 剂 (上 海 生 工 ; HRP-山 羊 抗 小 鼠 IgG (华 美 生 物 工 程 公 司 ; 小 鼠 单 抗 Ig 亚 类 测 定 (McAb Isotype 试 剂 盒 (美 国 Pierce 公 司 ; 紫 外 分 光 光 度 计 (岛 津 ; 酶 标 仪 (芬

4、 兰 雷 勃 MK3 ; 洗 板 机 (北 京 天 石 ZMX-96 ; 其 他 试 剂 为 国 产 分 析 纯 。1.2方 法1.2.1小 鼠 免 疫 试 验用 纯 化 的 hLN 免 疫 小 鼠 。 首 次 免疫 以 抗 原 加 等 量 弗 氏 完 全 佐 剂 乳 化 , 小 鼠 腹 腔 注 射 0.2ml /只 (抗 原 含 量 约 70$g ; 间 隔 1个 月 后 以 抗 原 加 等 量不 完 全 佐 剂 乳 化 , 腹 腔 注 射 0.2ml /只 ; 于 融 合 前 3d , 尾 静 脉 注 射 抗 原 0.1ml 追 加 免 疫 1次 。 追 加 免 疫 与 第 2次人胎盘层粘

5、连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定曾宪威 , 蒋艺勤 , 肖静 , 杨元好(广东省深圳市宝安区松岗人民医院检验科 , 深圳518105【 摘 要 】 目 的获 得 能 特 异 性 识 别 人 层 粘 连 蛋 白 (hLN 的 单 克 隆 抗 体 (McAb 。 方 法用 纯 化 的 人 层粘 连 蛋 白 (hLN 作 抗 原 免 疫 Balb /C 小 鼠 , 以 细 胞 融 合 、 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 (ELISA 筛 选 和 克 隆 化 技 术 获 得 抗 hLN 的 杂 交 瘤 细 胞 株 ; 用 生 物 学 方 法 鉴 定 杂 交 瘤 细 胞 , 用 免 疫 学 方 法 鉴 定

6、McAb 的 特 异 性 。 结 果获 得 4株稳 定 分 泌 抗 人 LN 的 杂 交 瘤 细 胞 株 (2A1、 3B5、 2C4、 4D1 , 培 养 上 清 的 ELISA 效 价 分 别 为 :1 512、 1 1024、1 512、 1 256; 腹 水 效 价 分 别 为 :1×106、 1×107、 1×106、 1×105; 采 用 ELISA 相 加 法 表 明 2A1、 4D1与 3B5、 2C4识 别的 hLN 上 的 抗 原 决 定 簇 和 识 别 的 不 同 , 4株 单 抗 均 属 实 IgG 。 结 论成 功 建 立 了

7、4株 稳 定 分 泌 抗 人 LN McAb的 杂 交 瘤 细 胞 株 , 它 们 分 别 识 别 hLN 上 2个 不 同 的 抗 原 位 点 , 有 望 作 为 hLN 定 量 检 测 的 特 异 性 抗 体 。【 关 键 词 】 层 粘 连 蛋 白 ; 单 克 隆 抗 体 ; 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 ; 制 备 中 图 分 类 号 :Q513.2文 献 标 识 码 :APreparation and Identification of Monoclonal Antibody Against Human LamininZENG Xian-wei , JIANG Yi-qing ,

8、XIAO Jing , YANG Yuan-hao(Department of Labortory Medicine , People 5s Hospital of Songgang , Shenzhen 518105, China 【 Abstract 】 ObjectiveTo prepare a monoclonal antibody (McAb against human laminin (hLN . MethodsSpleen cells from Balb /c mice immunized with human laminin (hLN were fused with Sp2/0

9、myeloma cells. The specific McAb were screened by ELISA and identified by western blot. ResultsFour hybridoma cell lines (2A1, 3B5, 2C4and4D1 secreting specific McAb agaionst human laminin (hLN were selected and determined to recognize different epitops on human laminin. The titers of the culture su

10、pernatant determined by ELISA of the four clones were 1 512, 1 1024, 1 512, and 1 256; of the ascites were 1×106, 1×107, 1×106and 1×105. McAbs of 2A1and 4D1recognize one epitope on human laminin , whereas 3B5and 2C4recognize another epitope. 2A1, 4D1, 3B5and 2C4are IgG McAbs.Conc

11、lusionFour hybridoma cell lines producing high titer and specific McAbs against the human laminin were established.【 Key words 】 laminin ; McAb ; ELISA ; preparation作者简介 :曾宪威 (1965 , 男 , 主管技师 , 从事专业为临床医学检验。 基础研究论著 文章编号 1672-3619(200707-0636-03636 热带医学杂志 2007年 7月第 7卷第 7期表 1杂 交 瘤 细 胞 的 染 色 体 计 数 及 Ab

12、Ig 亚 类 鉴 定 Tab.1Counting of the hybridoma cell line chromosomes and the monoclonal antibody isotyping identification细 胞 株2A1 3B5 2C4 4D1每 个 细 胞 染 色 体 数 目1019899107Ig 亚 类IgG1IgG1IgG2aIgG1轻 链 McAb 亚 类 表 2不 同 细 胞 株 McAb 抗 原 表 位 的 鉴 定Tab.2Resultes of AI (% between hybridoma cells by ELISA (450nm AI (% 2

13、A1 3B5 2C4 4D1 2A1-86.380.831.63B578.4-29.576.52C482.230.4-86.44D1 28.6 77.8 75.4 -免 疫 的 间 隔 时 间 至 少 为 4周 。1.2.2McAb 制 备 6取 免 疫 小 鼠 脾 细 胞 与 Sp2/0骨 髓 瘤 细 胞 , 按 1 10在 50%PEG (Mr 4000 作 用 下 融 合 , HAT 培 养 液 选 择 培 养 后 改 用 HT 培 养 液 , 间 接 ELISA 筛 选 , 对 阳 性 孔 进 行 有 限 稀 释 法 克 隆 和 亚 克 隆 , 多 次 克 隆 化 后 进 行 杂 交

14、瘤 细 胞 扩 大 培 养 和 制 备 单 抗 腹 水 。 培 养 上 清 及 腹 水 效 价 均 采 用 间 接 ELISA 测 定 。1.2.3McAb 筛 选 及 效 价 测 定 方 法 以 纯 化 的 hLN 1" g / ml 包 被 PVC 板 (包 被 液 是 pH 9.6的 碳 酸 盐 缓 冲 液 , 每 孔 0.1ml , 4 过 夜 , 2%BSA 封 闭 , 洗 涤 后 分 别 加 被 检 样 本 50" l , 37 孵 育 30min , 洗 涤 后 加 入 HRP-山 羊 抗 小 鼠 IgG 50" l , 37 孵 育 30min ,

15、 洗 涤 5次 , 加 底 物 TMB 室 温 显 色 15min , 加 2mol /L 的 硫 酸 50l 终 止 反 应 , 测 定 A 450值 判 定 结 果 。1.2.4杂 交 瘤 细 胞 染 色 体 计 数 取 生 长 良 好 的 杂 交 瘤 细 胞 悬 液 1ml , 加 秋 水 仙 碱 至 终 浓 度 0.02" g /ml , 室 温 作 用 3h 后 PBS 洗 涤 并 离 心 除 去 培 养 夜 , 加 0.075mol /L KCL 10ml , 轻 轻 吹 散 沉 淀 的 细 胞 , 室 温 放 置 约 30min , 离 心 弃 上 清 , 经 固 定

16、、 滴 片 、 Giemsa 染 色 油 镜 下 观 察 染 色 体 并 计 数 。1.2.5McAb Ig 亚 类 测 定 McAb Isotyping 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 所 测 小 鼠 Ig 亚 类 包 括 IgGl 、 IgG2a 、 IgG2b 、 IgG3、 IgM 、 IgA 、 、 。1.2.6McAb 特 异 性 测 定 7将 分 子 量 标 准 蛋 白 及 hLN 纯 品 作 SDS-PAGE 电 泳 , 再 经 转 移 电 泳 将 蛋 白 转 移 至 PVDF 膜 上 , 将 膜 在 4 , 用 2%BSA 封 闭 过 夜 后 , 分 别 加 入 不 同

17、株 的 McAb 腹 水 , 37 反 应 40min , 加 入 HRP-山 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 , 孵 育 并 充 分 洗 涤 , 加 底 物 DAB , 室 温 约 30min 左 右 , 可 产 生 清 晰 的 棕 色 条 带 , 用 去 离 子 水 冲 洗 终 止 反 应 。1.2.7McAb 抗 原 表 位 的 鉴 定 识 别 抗 原 表 位 的 鉴 定 采 用 ELISA 相 加 法 , 即 :将 50" l 浓 度 为 2" g /ml 的 hLN 抗 原 包 被 聚 苯 乙 烯 塑 料 板 , 4 封 闭 过 夜 。 PBST 液 洗 3次 ,

18、 凉 干 , 用 200ml /L FCS-PBST 封 闭 , 37 2h , 洗 涤 3次 。 分 别 加 入 不 同 株 的 杂 交 瘤 细 胞 上 清 液 或 等 量 的 两 两 配 对 杂 交 瘤 细 胞 上 清 液 , 将 正 常 Balb /C 小 鼠 的 眼 球 血 按 照 1 1000稀 释 , 设 置 为 阴 性 对 照 。 每 一 标 本 设 置 3复 孔 , 结 果 取 其 均 值 。 温 育 后 , 洗 3次 , 加 HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG 100" l , 37 孵 浴 1h , 同 上 洗 涤 , TMB 室 温 下 显 色 10min

19、, 加 2mol /L H 2S0450" l 终止反应 , 用酶标仪在 450nm 测 各 孔 OD 值 , 按 下 列 公 式 计 算 相 加 系 数 :AI=2A 1+2/(A 1+A 2 -1×100%如 AI 值 >50%, 则 相 加 实 验 阳 性 , 说 明 2株 单 抗 间 没 有 竞 争 性 抑 制 现 象 , 表 位 不 同 , 反 之 , 则 存 在 竞 争 性 抑 制 现 象 , 具 有 相 同 的 抗 原 表 位 。2结果2.1杂 交 瘤 细 胞 系 的 建 立脾 细 胞 与 Sp2/0的 融 合 率 达 到 97%以 上 (836/862

20、 孔 , 间 接 ELISA 初 次 筛 选 得 到 15个 阳 性 孔 。 经 反 复 免 疫 筛 选 , 4次 克 隆 化 后 , 得 到 4株 克 隆 生 长 好 , 经 检 测 呈 阳 性 的 杂 交 瘤 细 胞 , 分 别 命 名 为 2A1、 3B5、 2C4、 4D1, 均 能 够 保 持 体 外 连 续 传 代 3个 月 以 上 , 液 氮 中 冻 存 后 复 苏 仍 能 稳 定 分 泌 抗 体 且 效 价 不 变 。2.2McAb 的 鉴 定2.2.1杂 交 瘤 细 胞 特 性 分 析 2A1、 3B5、 2C4、 4D1细 胞 核 型 分 析 染 色 体 数 为 98-10

21、7条 , 有 端 着 丝 粒 和 标 志 染 色 体 。 流 式 细 胞 仪 分 析 表 明 2A1、 3B5、 2C4、 4D1DNA 含 量 高 于 Sp2/0细 胞 。2.2.2效 价 测 定 及 Ig 类 别 鉴 定 经 间 接 ELISA 测 定 , 2A1、 3B5、 2C4、 4D1培 养 上 清 的 ELISA 效 价 分 别 为 1 512、 1 1024、 1 512、 1 256; 腹 水 效 价 分 别 为 1×106、 1×107、 1×106、 1×105; 试 剂 盒 检 测 条 带 上 显 示 2A1、 3B5、 4D1均

22、 为 IgGl , 而 2C4为 IgG2(表 1 。2.2.3特 异 性 试 验 纯 化 hLN 经 SDS-PAGE , 转 移 至 PVDF 膜 上 , 经 免 疫 印 迹 显 示 , 4株 McAb 均 与 hLN 条 带 发 生 特 异 性 结 合 反 应 (图 1 。2.2.4McAb 识 别 抗 原 表 位 的 鉴 定 采 用 ELISA 相 加 法 , 用 酶 标 仪 在 450nm 测 各 孔 OD 值 , 并 计 算 AI 值 (表 2 , 说 明 2A1、 4D1与 3B5、 2C4是 针 对 hLN 不 同 抗 原 决 定 簇 。3讨论层 粘 连 蛋 白 的 检 测 主

23、 要 应 用 于 肝 纤 维 化 诊 断 、 门 静 脉 图 14株 McAb 与 hLN 免 疫 印 迹 实 验Fig.1Western blot analysis of binding 4McAb with hLN 1:2A1; 2:3B5; 3:2C4; 4 :4D1637 Journal of Tropical Medicine Vol.7No.7Jul.2007! (上 接 第 635页 7 8 91011SKURRAY RA. Proton-dependent multidrug efflux systems J .Microbiol Rev , 1996, 60(4 :575-6

24、08.JACK DL , YANG NM , SAIER MH. The drug /metabolitetransporter superfamily J Eur J Biochem , 2001, 268(13 :3620-3639.NINIO S , ELBAZ Y , SCHULDINER S. The membrane topologyof EmrE-a small multidrug transporter from Escherichia coliJ . FEBS Lett , 2004, 562(1-3 :193-196.CONSEIL G , PEREZ -VICTORIA

25、JM , JAULT JM , et al.Protein kinase C effectors bind to multidrug ABC transportersand inhibit their activity J Biochemistry , 2001, 40(8 :2564-2571.SHABAAN AM , MOHAMED MM , ABDALLAH MS , et al. Cloning and characterization of a Schistosoma mansoni 1H and 30S clones as two tegumental vaccine candid

26、ate antigens J . Acta Biochim Pol , 2003, 50(1 :269-278.GOBERT GN , STENZEL DJ , MCMANUS DP , et al. The ultrastructural architecture of the adult Schistosoma japonicum tegument J . Int J Parasitol , 2003, 33(14 :1561-1575. 收 稿 日 期 :2007-04-10; 修 回 日 期 :2007-05-20高 压 判 断 4及 肿 瘤 侵 润 5等 方 面 有 重 要 的 临

27、床 价 值 , 所 以 层 粘 连 蛋 白 的 研 究 是 目 前 较 为 活 跃 的 领 域 之 一 。虽 然 LN 的 发 现 已 多 年 , 国 内 外 少 数 实 验 室 建 立 放 射 免 疫 和 酶 免 检 测 方 法 , 但 试 剂 的 稳 定 性 、 灵 敏 度 、 线 性 范 围 和 操 作 的 简 便 性 等 存 在 较 大 的 问 题 。临 床 推 广 困 难 , 主 要 原 因 之 一 就 是 因 为 缺 乏 高 质 量 的 单 克 隆 抗 体 。 本 研 究 应 用 自 制 用 纯 化 的 人 层 粘 连 蛋 白 (hLN 作 抗 原 免 疫 Balb /C 小 鼠

28、, 以 细 胞 融 合 、 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 (ELISA 筛 选 和 克 隆 化 技 术 获 得 抗 hLN 的 杂 交 瘤 细 胞 株 , 与 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 融 合 建 立 了 4株 能 稳 定 分 泌 抗 hLN McAb 的 杂 交 瘤 细 胞 株 , 并 获 得 了 针 对 hLN 上 两 个 不 同 抗 原 决 定 簇 的 McAb 。 初 步 研 究 表 明 , 这 4株 McAb 与 抗 原 具 有 良 好 的 亲 和 性 和 特 异 性 , 为 建 立 双 抗 体 夹 心 法 检 测 人 血 清 中 层 粘 连 蛋 白 方 法 奠 定 了 物 质 基 础 。参 考 文 献 TIMPL R , ROHDE H , ROBEY PG , et al.L