利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用

1、利用siRNA对细胞上胰岛素受体的抑制作用        【摘要】  目的: 利用siRNA抑制 TC3细胞中胰岛素受体基因的表达. 方法: 化学合成胰岛素受体(IR)基因的4对特异siRNAs(实验组:siRNA1组,siRNA2组,siRNA3组,siRNA4组)和1对非特异siRNA(NC组). 通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染 TC3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率;应用逆转录PCR检测IR mRNA表达. 结果: 50,100,150,200 nmol/L siRNA

2、转染 TC3细胞24 h后,转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%,选择100 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度. 转染100 nmol/L siRNAs 24 h后,与对照组相比siRNA1,2,3,4组 TC3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调, 其中以siRNA2组抑制效果最为明显,表达减少了70.5%. 结论: 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达,为进一步研究细胞上IR 的功能提供了实验基础.     【关键词】

3、  受体,胰岛素; RNA, 小分子干扰; RNA干扰;转染    0引言    胰岛素受体(insulin receptor, IR)编码基因突变可直接导致胰岛素作用的降低,IR基因及蛋白表达量下调或IR降解增加可导致胰岛素分泌障碍1. 有研究2-3表明细胞上有IR和4种胰岛素受体底物蛋白(IRS)1,2,3,4及其下游的转导蛋白表达. 细胞中的胰岛素信号转导蛋白可以被葡萄糖或直接被胰岛素刺激所活化,细胞也是胰岛素作用的靶细胞4. 但是通过RNA干扰技术阻断细胞上IR后对2型糖尿病发病机制的相关研究还较少. 我们利用RNA

4、干扰技术,以IR基因为靶点,设计了4条小干涉RNA(siRNA),期待找到可以明显干扰细胞上IR表达的siRNA片段,为进一步探讨细胞上IR在2型糖尿病发病机制中的作用提供实验基础.    1材料和方法    1.1材料细胞培养基RPMI1640(美国Gibco公司);胰蛋白酶,Trizol和脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);反转录相关试剂(Fermentas公司);2×Taq PCR Master Mix(北京天为时代科技有限公司);

5、PCR扩增引物由上海捷瑞生物有限公司合成. IR引物:上游引物,5GAA GAT CAC CCT TCT TCG AG3;下游引物,5CAG TGA GTC TCT CTG GAC AG3,扩增产物为737 bp. GAPDH引物:上游引物,5AAT TCA ACG GCA CAG TCA AGG C3;下游引物,5GGA TGC AGG GAT GAT GTT CTG G 3,扩增产物467 bp.    1.2方法    1.2.1siRNA的设计、合成与配制根据GenBank获得小鼠IR基因(GenBank登录号:NM_0105

6、68)的cDNA序列,从Ambion公司提供的网上设计工具siRNA Design Tools (http:/www.ambion.corn/teehlib/mise/siRNAtols.html)参照siRNA设计原则5挑选4条特异性寡核苷酸序列作为靶序列(Target Sequence, TS),分别为:TS1 5GAG GCT GCA CTG TGA TCA A3;TS2 5AGA TTA TCT TAA AGT GGA A3;TS3 5GGA CCA TGC CTG AAG CTA A3;TS4 5GGA TCG AGT TCC TCA ATG A3,并进行全基因组扫描(BLAST)和

7、序列同源分析(通过NCBI提供的基因组数据库和分析软件进行),确保选择的siRNA序列与基因组中其他基因无明显同源性. siRNA目的序列委托上海吉码生物有限公司合成,并同时合成与IR基因序列无关的siRNA作为阴性对照(negative contro1, NC),阴性对照正义链的5端有FAM荧光标记. 合成序列如下: siRNA1正义链:5GAG GCU GCA CUG UGA UCA AdTdT3,反义链:5UUG AUC ACA GUG CAG CCU CdGdG3;siRNA2正义链:5AGA UUA UCU UAA AGU GGA AdTdT3,反义链:5UUC CAC UUU AA

8、G AUA AUC UdGdA3;siRNA3正义链:5GGA CCA UGC CUG AAG CUAAdTdT3,反义链:5UUA GCU UCA GGC AUG GUC CdGdG3;siRNA4正义链:5GGA UCG AGU UCC UCA AUGAdTdT3,反义链:5UCA UUG AGG AAC UCG AUCCdGdT3;NC正义链:5FAMUUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT3,反义链:5ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT3. 配制:用150 L无核酸酶水稀释3.0 nmols的siRNA,终浓度为20 mol/L分装,-70保存.

9、60;   1.2.2细胞培养小鼠胰岛细胞瘤 TC3细胞株由本科实验室保存,于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液37,50 mL/L CO2条件下培养,隔日传代.    1.2.3siRNA转染将对数生长期的 TC3细胞按3×105个/孔接种至6孔板,用无抗生素的100 mL/L胎牛血清培养液培养,24 h内细胞生长达培养孔底面积40%60%时进行转染. 实验分空白对照组,不做任何处理;阴性对照组转染与IR基因序列无关的siRNA;siRNAs实验组分别转染siRNA1,siRNA2,siRNA3,siRNA4,每组3

10、个复孔. 用Lipofectamine 2000转染,按说明书操作进行,使siRNAs终浓度除剂量实验中浓度为50,100,150,200 nmol/L外,其余均为100 nmol/L. 在37,50 mL/L CO2条件下培养4 h后补加含血清、不含抗生素的正常培养液2.5 mL.    1.2.4siRNA转染效率的检测预先在六孔板中放入盖玻片,接种细胞,转染siRNA 24 h后,取出盖玻片置于载玻片上,950 mL/L甘油封片,荧光显微镜下观察不同剂量siRNA转染细胞效率. 分别在自然光和荧光激发光源下观察转染的细胞,每组10个视野记数绿色荧光细胞数与白

11、光下总细胞数的百分比,取其平均值作为转染效率.    1.2.5RTPCR检测IR mRNA基因转录水平实验参照说明书进行. 用Trizol提取各组转染后细胞总RNA,取2 g RNA用MMLV逆转录酶合成cDNA以cDNA为模板PCR扩增IR片段,25 L反应体系:cDNA模板3 L,2×PCR Mix 12.5 L,上、下游引物各1 L(10 mol/L),ddH2O 7.5 L. 反应条件(35个热循环的参数):94 45 s,57 30 s,72 60 s,共35个循环;GAPDH为内参照. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,通过自动凝胶成

12、像分析系统,将电泳结果进行扫描分析.    统计学处理:计量资料以x±s表示,组间比较使用SPSS11.0软件进行方差分析及NPar Test.    2结果    2.1siRNA转染效率分析荧光标记的NC组转染细胞24 h后,在50,100,150,200 nmol/L浓度下转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%(图1). 50 nmol/L NC组与100,150,200 nmol

13、/L NC组转染效率比较差异均有统计学意义(P<0.05),而后3组两两之间比较差异无统计学意义,故选择100 nmol/L作为转染siRNA的实验浓度.    2.2siRNA对IR基因表达的抑制提取转染100 nmol/L siRNAs 24 h后各组细胞的总RNA,用RTPCR测定对IR基因表达的影响. IR基因扩增产物为737 bp;内参照GAPDH扩增产物为467 bp. 与空白对照组相比siRNA1,2,3,4组 TC3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调,其中以siRNA2组干扰效果最为明显,表达减少了70.5%(图2). 

14、0;  3讨论    研究6发现,细胞胰岛素受体基因敲除( IRKO)小鼠出现了与人2型糖尿病发病初期相似的临床特征: 葡萄糖刺激的胰岛素第一时相分泌丧失80%以上,雄性 IRKO小鼠的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)几乎完全消失,雌性 IRKO小鼠GSIS极度迟钝,同时伴有胰岛素水平降低,但对精氨酸刺激的反应仍然保持. 表明细胞的胰岛素受体对维持葡萄糖刺激的胰岛素第一时相分泌是必不可少的. 而过度表达细胞上胰岛素受体后,葡萄糖刺激后的胰岛素分泌较对照组明显增加7. 因此对细胞上IR的相关研究可以为2型糖尿病的发病机制提供一定的依据. 

15、60;  A,B: 50 nmol/L NC组; C,D: 100 nmol/L NC组; E,F: 150 nmol/L NC组; G,H: 200 nmol/L NC组; I,J: 空白对照组. A,C,E,G,I:荧光下 TC3细胞; B,D,F,G,J: 白光下 TC3细胞.    图1不同浓度siRNAs转染 TC3细胞的转染效率FAM ×200(略)    M: DNA marker; 1: siRNA1组; 2: siRNA2组; 3: siRNA3组; 4: siRNA4组; 5: NC组; 6:

16、空白对照组. A: IR mRNA; B: GAPDH mRNA.    图2RTPCR检测转染siRNAs后各组细胞IR mRNA的水平(略)    RNA干扰是最近发展起来的一种抑制特定基因表达的新方法,它是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA,阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制8. 在哺乳动物细胞介导RNAi效应的主要是siRNA分子,其大小约2123 bp. 瞬时转染化学合成的siRNA时,不同的siRNA浓度可以引起靶基因水平不同程度的下调9,因此,我们通过选择带有FAM标记的阴性对照,选择100 nm

17、ol/L作为转染siRNA的实验浓度.    不同的siRNA对基因的下调有序列选择性10,因此在本实验中我们设计了4条不同靶序列的siRNA片段,在mRNA水平分别检测了4条siRNA片段的抑制效果,其中siRNA2组的抑制效果最明显,表达减少了70.5%. 这为此后的细胞功能研究奠定了基础.    【参考文献】    1 Ohsugi M, CrasMéneur C, Zhou Y, et al. Reduced expression of the insulin receptor in m

18、ouse insulinoma (MIN6) cells reveals multiple roles of insulin signaling in gene expression, proliferation, insulin content, and secretion J. J Biol Chem, 2005, 280(6):4992-5003.    2 Verspohl EJ, Ammon HP. Evidence for presence of insulin receptors in rat islets of Langerhans J. J Cl

19、in Invest, 1980,65(5):1230-1237.    3 Harbeck MC, Rothenberg PL. A technique for isolating single cells for analysis+by reverse transcription polymerase chain reaction J. Anal Biochem, 1995,230(1):193-196.    4 Roper MG, Qian WJ, Zhang BB, et al. Effect of the insulin m

20、imetic L783,281 on intracellular Ca2+ and insulin secretion from pancreatic betacells J. Diabetes, 2002, 51(Suppl)1: S43-S49.    5 LinksSchwarz DS, Ding H, Kennington L, et al. Designing siRNA that distinguish between genes that differ by a single nucleotideJ. Plos Genet, 2006,2(9):1307-1318.    6 Kulkarni RN, Brüning JC, Winnay JN, et al. Tissuespecific knockout o