用SPR生物传感器研究纤维蛋白原在生物医用材料表面的吸附

1、    用SPR生物传感器研究纤维蛋白原 在生物医用材料表面的吸附        摘要：材料表面对血浆蛋白的吸附特性，是研究和评价生物医用材料血液相容性的重要依据。本文用自制的表面等离激元(SPR)传感器，测量了金膜、磷脂DSPC膜、成都科大型聚氨酯、Pellethane 2363-55D聚氨酯及有机玻璃膜表面对纤维蛋白原的动态吸附特性，在纤维蛋白原溶液浓度为5mg/ml的相同条件下，磷脂DSPC膜表面吸附纤维蛋白原的速度最低，饱和吸附浓度也最小(表面浓度为1ng/

2、mm2)。其次是裸金膜(表面浓度为3.5ng/mm2)，再其次是成都科大型聚氨酯膜(表面浓度为3.8ng/mm2)和Pellethane 2363-55D聚氨酯(表面浓度为4.3ng/mm2)，吸附速度和吸附量最高的是有机玻璃膜(表面浓度为4.5ng/mm2)。结果表明，材料表面对纤维蛋白原的吸附动力学特性，与材料的血液相容性密切相关。表面等离激元技术与本文采用的在金膜上铺展高分子材料的离心铺膜法和LB技术等样品制备技术相结合，为生物材料表面对蛋白质吸附特性的实时、动态、原位研究提供了一种新的高灵敏度的方法，并可能发展成为一种材料生物相容性的测试和评价的新方法。关键词：表面等离激元共振；纤维蛋

3、白原；生物材料；表面吸附分类号：R318.08; O647.3ADSORPTION OF FIBRINOGEN ON THE SURFACES OF BIOMATERIALS STUDIED BY USING SURFACE PLASMONRESONANCE (SPR) SENSORXiao CaideSui SenfangGong YandaoZhang XiufangZhao Nanming（State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Department of BiologicalSciences and

4、 Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084）ABSTRACT：In this work, dynamic characteristics of fibrinogen adsorption onto the surfaces of gold, monolayer of distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), polyurethane(PU) made by Chengdu University of Science and Technology (CUST Type PU),PU made by D

5、OW Chemistry, USA (Pellethane 2363-55D) and plexiglass were measured by using a self-made surface plasmon resonance (SPR) sensor. Different behavior of fibrinogen adsorption onto different surfaces were observed at the same fibrinogen concentration of 5 mg/ml. The phospholipid monolayer showed the l

6、owest speed and the smallest equilibrium surface concentration of adsorbed fibrinogen (Cs=1ng/mm2），followed by the gold film (Cs=3.5ng/mm2),CUST Type PU(Cs=3.8ng/mm2) and pellethane 2363-55D(Cs=4.3ng/mm2). The plexiglass has shown the highest speed and the largest equilibrium surface concentration o

7、f adsorbed fibrinogen (Cs=4.5ng/mm2). It showed that the dynamic characteristic of fibrinogen adsorption onto material surface was closely related to the hemocompatibility. SPR technique combined with the methods of material spreading onto the surface of gold developed in this work, including the po

8、lymer spreading by centrifugation and lipid spreading by LB technique, provided us a very sensitive tool for the real-time, dynamic and in-situ study of protein adsorption on the surface of biomaterials. It will be promising to use these techniques in the measurement and evaluation of biocompatibili

9、ty of materials.Key words：Surface plasmon resonance (SPR); Fibrinogen; Biomaterials, Surface adsorption0引言纤维蛋白原是在凝血和溶血过程中起关键作用的一种重要的血浆蛋白，对用于心血管系统的生物医用材料来说，材料表面形成血栓是影响其血液相容性的重要因素。材料与血液接触后血浆蛋白在材料表面的吸附被认为是血栓形成的重要诱因，材料吸附的血浆蛋白的种类、吸附量、吸附速率及表面吸附引起的血浆蛋白的结构功能变化，是研究和评价材料血液相容性的重要依据。研究和测量表面吸附速率和吸附量的方法中，使用得最多的是同

10、位素标记1，但该方法操作比较复杂，容易造成放射性污染，且难于原位检测动态吸附过程，表面等离激元共振(Surface Plasma Resonance, SPR)技术2，3近年来被广泛地用来研究和检测生物分子之间的识别和特异性相互作用，是研究分子识别和分子间相互结合、相互作用的有力手段。本文报道了用自己研制的表面等离激元共振(SPR)传感器4对纤维蛋白原在几种血液相容性不同的材料表面动态吸附特性进行的研究。1材料和方法1.1材料二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和纤维蛋白原均为Sigma产品，成都科大型聚氨酯，溶于四氢呋喃；聚氨酯Pellethane 2363-55D为美国DOW Chemistry

11、产品，溶于二甲基甲酰胺；有机玻璃为国产工业用有机玻璃板，切碎后溶于四氢叶喃。所用的Tris-HCl缓冲液浓度为20mM(pH7.4,含0.85%NaCl)。用Tris-HCl缓冲液将纤维蛋白原配制成5mg/ml的溶液。其它化学试剂均为国产分析纯。1.2仪器的原理和测量方法1是自制的SPR生物传感器的示意。激光通过三棱镜耦合与金膜中的自由电子气相互作用。在某一个入射角度激光可以激发金膜中自由电子气的一种电磁波模式(表面等离激元)2，3，导致入射的激光能量被金膜吸收，使得三棱镜底面上光线入射角与反射率关系曲线上出现一个共振吸收峰SPR谱。因为SPR谱峰的入射角对金膜表面折射率变化非常敏感，而折射率

12、变化与金膜表面吸附的蛋白量成正比5，因此用光电探测器连续检测表面等离激元共振吸收峰随时间的变化就可以实时地监测生物大分子间的反应动力学过程，定量测定不同材料表面吸附纤维蛋白量的差别。在所采用的实验条件下，金膜厚度、盖玻片和匹配介质油厚度对谱峰的影响小于10-4度。因此仪器的重复性、最低检出限取决于SPR仪的测角精度。我们自制的SPR仪的测角的最小分度为0.01°，根据和的关系，的最小分度为0.005°，根据光线在多层膜体系的反射和透射理论计算可知：在样品吸附过程中表面等离激元共振谱峰位移SPR或SPR反映了样品厚度和折射率的信息。如果已知样品的折射率可以算出角位移与样品厚度

13、成正比，由此可估算出对蛋白质样品的最低检测限为0.05ng/mm2。考虑仪器在自动扫描过程中齿轮之间空程差导致的测量误差，最低检测精度应不低于0.5ng/mm2。1SPR生物传感器测量纤维蛋白原在材料表面吸附的示意三棱镜被固定在由X射线衍射仪测角器改装的平台上以0.500°/s的角速度顺时针转动，光电检测器以1.000°/s的角速度跟踪反射光。是三棱镜底面的法线与入射光的夹角，是三棱镜底面与入射光的夹角。实验中记录的SPR谱是反射光光强与的关系曲线。反射光光强信号被放大后由12位A/D转换板分解成数字信号。一个反射光强的A/D单位相当1/4096伏特。所用激光光源是日立HL

14、6711G型激光二极管。波长为670nm。三棱镜是由7号重火石玻璃加工的等腰直角棱镜，边长为250mm，X射线衍射仪测角器的测角精度为0.01°。在20×20×0.1mm3大小的盖玻片的一面镀一层约50nm厚的金膜，将镀金盖玻片用水贴在离心机转台的中心，金膜向上。在离心机以2000转/min的速度转动时把溶于有机溶剂的高分子材料滴在金片上，依靠离心使高分子材料均匀铺在金膜上，待离心机停止转动后取下盖玻片备用。采用LB膜技术将单层磷脂膜水平转移到金膜表面6。在镀金盖玻片未镀金的一面上涂一点香柏油，按1所示将盖玻片贴在三棱镜的底面。将容积为250l的样品池用螺丝压靠在

15、金面上。向样品池中手动加入150l前述Tris-HCl缓冲液，启动自己编制的SPR控制程序，计算机自动在包含SPR谱峰的3°范围内每隔52秒扫描1次SPR谱。记录谱峰所对应的入射角SPR和当时的时间，记录本底后，再滴入纤维蛋白原溶液，用SPR变化的绝对值与时间的关系曲线反映金膜表面物质的吸附过程，测量在室温下进行。2试验结果2给出了裸金膜的SPR谱和表面铺展了一层成都科大型聚氨酯后的金膜的SPR谱，裸金膜谱峰所对应的入射角度SPR为63.18°，金膜表面铺一层成都科大型聚氨酯膜后，SPR谱峰SPR移到61.63°。由于一层磷脂膜(2nm)能使谱峰位移0.5

16、6;，因此估计铺在金膜表面的聚氨酯膜的厚度约为6纳米。在样品池中加150l缓冲液，由于水的折射率比空气高，铺有成都科大型聚氨酯的金膜在水相的SPR谱峰SPR位移到31.48°，向样品中加2l纤维蛋白原后SPR谱峰开始移动，1h后蛋白在成都科大型聚氨酯膜上的吸附基本达到平衡，谱峰位移到30.70°。2 监测金膜表面的成都科大型聚氨酯膜以及吸附在该聚氨酯膜表面的纤维蛋白原的SPR谱铺聚氨酯膜之前在空气中先测裸金膜的SPR谱(谱峰SPR=63.18°)，金膜表面铺一层聚氨酯膜后的SPR谱峰SPR移到61.63°，表明在金膜表面的聚氨酯膜的厚度约为6纳米。然后在

17、1所示的样品池中加150l缓冲液，铺有该聚氨酯的金膜在水相的SPR谱峰SPR位移到31.48°，向样品中加2l×5l/l纤维蛋白原1h后的SPR谱峰位移到30.70°。3所示是铺有有机玻璃、Pellethane 2363-55D以及铺有一层DSPC磷脂膜的金膜表面吸附纤维蛋白原的过程中谱峰?SPR变化的绝对值随时间的变化过程，中还显示了在裸金膜表面纤维蛋白原吸附量变化的动态过程。t(s)3纤维蛋白原在金膜以及分别铺有一层磷脂DSPC膜、成都科大型聚氨酯膜、有机玻璃膜和Pellethane 2363-55D膜的金膜表面吸附过程中SPR谱峰的位移随时间的变化实验条件与

18、2相同，中各样品加入纤维蛋白原的时间分别为：有机玻璃，第200s;Pellethane, 第300s;DSPC，第500s;成都科大型聚氨酯，第550s;裸金膜，第800s。3讨论根据文献5，SPR谱峰SPR每增加0.1°，对应的蛋白吸附密度增加1ng/mm2。由光的折射定律，从1中可以推出：和有线性关系。这种关系由2中上下两个横坐标表示，每增加0.1°对应减少0.2°，因此在3中SPR谱峰SPR位移的绝对值每0.2°对应吸附的蛋白表面浓度为1ng/mm2。从3可以看出被磷脂DSPC膜覆盖的金膜表面吸附蛋白最少(表面浓度为1ng/mm22)。成都科大型聚

19、氨酯表面吸附的蛋白表面浓度为3.8ng/mm2，裸金膜表面吸附的纤维蛋白原表面浓度为3.5ng/mm2。在磷脂DSPC膜表面吸附纤维蛋白原的速度比较慢，大约需要30min达到饱和，而在其它四种材料表面纤维蛋白吸附的速度较快，15min基本达到饱和。纤维蛋白原是分子量为340Kd的三球棒体，两端的球的直径为6纳米，中间的球直径为5纳米。按蛋白分子的面积推算出一层均匀吸附的纤维蛋白原的表面密度约为5.5ng/mm2。由此推测纤维蛋白原在上述几种材料表面的吸附可能是单层吸附。如果用吸附纤维蛋白原的速度和吸附量(表面吸附浓度)作为材料血液相容性的评价指标，则从本实验的结果可以将所用的几种材料血液相容性

20、依次排列如下：磷脂DSPC，裸金膜，成都科大型聚氨酯，Pellethane 2363-55D，有机玻璃。中性磷脂DSPC是天然细胞膜脂成分，其优良的血液相容性早已为实验证实7。成都科大型聚氨酯、Pellethane 2363-55D都是血液相容性较好的生物医用高分子材料，有机玻璃和裸金膜一般认为是血液相容性较差的材料。但仅从本实验的结果来看，这几种材料表面对纤维蛋白原的吸附速度和吸附量与我们原来对它们的血液相容性的印象并不是完全对应的。例如，裸金膜对纤维蛋白原的吸附速度和吸附量居然低于两种聚氨酯，就出乎我们的预料；成都科大型聚氨酯对纤维蛋白原的吸附速度和吸附量明显低于Pellethane 2363-55D，是否意味着其血液相容性明显优于后者，也有待其它实验的证实。文献8认为，材料表面对纤维蛋白原的吸附速度和吸附量多少可能与材料表面的疏水特性有关。本实验的结果是支持这一看法的。本文中，水平转移到金膜表面的磷脂膜的极性头朝外，因此覆盖着磷脂膜的金膜表面具有亲水特性，磷脂膜表面吸附的蛋白也最少；而裸金膜表面和覆盖有一层高分子材料的金膜表面具有疏水特性，有机玻璃表面的疏水特性最明显，样品池中的缓冲液液面呈现半圆状突起，