碱性成纤维细胞生长因子促进大鼠硬腭穿孔的愈合

1、    碱性成纤维细胞生长因子促进大鼠硬腭穿孔的愈合        摘要 目的：研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对硬腭穿孔愈合的影响。方法：在大鼠硬腭部制作早期硬腭穿孔动物模型，外用bFGF治疗硬腭穿孔。采用肉眼观察、病理学检查的方法进行评价。结果：肉眼观察发现bFGF组伤口愈合率明显高于对照组(P0.01); 病理学检查表明bFGF能刺激肉芽组织的增长，成纤维细胞分裂增殖; bFGF组成纤维细胞的核仁形成区嗜银蛋白颗粒数目为3.73±0.52，对照组为2.

2、11±0.31(P0.05)。结论：bFGF有助于肉芽组织的生长，具有显著促进硬腭穿孔创伤愈合的作用，有助于硬腭穿孔的修复。主题词 成纤维细胞生长因子， 碱性; 腭裂; 伤口愈合中分类号 R782.2 文献标识码 A文章编号1000-4718(2000)05-0451-03 Basic fibroblast growth factor promoting the healing of palatal perforation in ratsKONG Wei-dong, LIN Wei, LI Xiao-lan, SHEN Li-jia, DENG Guo-zheng( Dept. of

3、 Stomotology, First Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632， China）Abstract AIM: To study the influence of basic fibroblast growth factor(bFGF) on treating early palatal perforation in rats. METHODS: bFGF was given to the early palatal perforation in rat. The granu

4、lation tissues in perforations were grossly and pathologically observed. RESULTS: The rate of wound healing was significantly increase in the bFGF group (P0.01). bFGF could obviously promote the proliferation of the granulation tissues and fibroblasts. The number of AgNORs granules in fibroblasts we

5、re 3.73±0.52 in the bFGF group and 2.11±0.31 in control group (P0.05). CONCLUSION: bFGF could promote the growth of granulation tissues and had a strong promotion on the wound healing in palatal perforation. It was helpful in repairing palatal perforation. MeSH Fibroblast growth factor, ba

6、sic; Cleft palatal; Wound healing 腭裂术后穿孔是腭裂术后最常见的并发症，早期曾有学者报告其发生率高达45%60%，近年来，多数学者报告的平均发生率为23%25.3%1，2。腭部穿孔往往影响患儿的吸吮和发音，食物反流入鼻腔易造成患儿的口腔卫生不良，以及中耳疾患和精神心理负担等，虽然有多种修复穿孔的方法，但术后再次发生穿孔的机率仍然很高，是临床医生颇感棘手的难题之一。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF) 是一种多功能的生物活性物质。它能够刺激间质组织分化，促进上皮组织、神经组织、血管组织的生长，因而对创

7、伤、烧伤、烫伤有较强的修复作用。先前临床研究表明3：在腭裂术后早期穿孔的病例局部使用bFGF治疗后，能使穿孔治愈，从而令患者避免了二次手术修复的痛苦。然而，关于bFGF治愈早期腭裂穿孔的作用和机制尚不明确，本研究用大鼠制作腭裂穿孔的动物模型，探讨bFGF对硬腭穿孔伤愈的作用。材料和方法一、材料bFGF是基因重组产品即人类基因重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor, rhbFGF) ，由本校生物工程研究所提供。每支1600 u，白色粉状，用时用1 mL生理盐水稀释。二、动物实验方法及分组腭裂穿孔的动物模型：选用

8、180200 g SD大鼠60只（由本院动物所提供），雌雄不限，随机将大鼠分为实验组和对照组。经腹腔注射2%戊巴比妥钠(剂量0.2 mL/100 g) 麻醉后，在大鼠硬腭正中，距上中切牙远中0.5 cm处用尖刀将硬腭粘骨膜、硬腭骨组织以及鼻底粘骨膜全层切除，使口腔和鼻腔相通，制造出直径为0.3 cm大小的硬腭穿孔，随后用生理盐水冲洗伤口，并让其伤口自然愈合。2周后检查发现：术后所有大鼠均形成0.3 cm直径大小的硬腭部穿孔，并以其作为腭裂术后穿孔实验的动物模型。自穿孔第2周起, 穿孔部位用生理盐水冲洗23次，将创口周围的食物残渣、坏死组织、污秽物质等冲洗干净，随后沿穿孔周边刮去部分上皮组织，让

9、新鲜肉芽组织暴露。在穿孔表面放入明胶海绵，并在周边用针缝合固定之。实验组伤口滴入0.2 mL的bFGF，对照组滴入0.2 mL的生理盐水。手术当日定为0天，术后第1d按同样方法处理创口，即生理盐水冲洗后，实验组伤口滴入0.2 mL的bFGF，对照组滴入0.2 mL的生理盐水。连续5 d重复上述给药过程。分别于术后3 d、5 d、7 d、10 d取材，10%中性甲醛固定，取材，缓慢脱水，包埋制片，苏木素-伊红染色，在光镜下观察记录，术后观察肉芽组织生长情况，测量创面面积大小，计算愈合率，愈合率=(1-现伤口面积)/ 原伤口面积×100%。核仁形成区嗜银蛋白染色(silver stain

10、ing nucleulus organizer regions, AgNORs)参见文献报道4，观察统计方法：在1 000倍油镜下对每例切片随机观察5个视野，每视野10个完整无重叠的成纤维细胞作AgNORs颗粒计数，以均数±标准差(±s)表示。采用t检验判断均数差异显著性。结果一、肉眼观察 实验组经使用bFGF治疗后第1 d，穿孔边缘组织开始出现少许红晕，有少量新鲜肉芽组织，穿孔面积大小未见缩小; 第2 d与第1 d结果相似，同样创口表面没有发生特殊改变; 第3 d后在穿孔边缘的部分区域出现沿表面不规则增生的新鲜肉芽组织，呈岛状生长，沿穿孔边缘排列; 第5 d肉芽组织明显向

11、心性、团块状、瘤样增生, 穿孔面积由于有来自不同方向生长肉芽组织而变得明显缩小, 穿孔处几乎由新鲜肉芽组织所替代;第7 d增生组织体积大于穿孔缺失组织，将穿孔部分完全封闭；第8 d肉芽组织体积缩小，见腭部粘膜有白色披膜在肉芽组织表面爬行；第9 d增生凸出的组织进一步变平整，第10 d肉芽组织及上皮与腭侧粘骨膜完全溶合于一起，增生组织变得平整，穿孔处被修复。而对照组伤口仅见薄层肉芽组织，伤口收缩不明显，口腔与鼻腔仍然相连通。二、愈合率的比较 从第3 d起，各实验组的肉芽组织愈合率(%)明显高于对照组(P0.01) 见表1。表1 bFGF组与对照组不同时期肉芽组织愈合率(%)的比较Tab 1 Co

12、mparison of the healing rate of granulation tissues between bFGF group and control group in different periods(%， n=6)Group0 d 3d 5d 7d 10d Control0 10.3 21.5 35.6 47.2bFGF 0 23.1* 43.3* 80.3*95.6* P0.01， vs control group 三、光镜下观察结果 3 d时bFGF组巨噬细胞数量明显增多（1），吞噬坏死组织，并伴有成纤维细胞增生，而对照组坏死组织未清除，大量炎性细胞浸润（2）。5 d时

13、bFGF组成纤维细胞增生明显，伤口表面有少量渗出及坏死组织，伤口边缘肉芽组织生长良好，血管增加（3）。而对照组成纤维细胞数量少、核小（4），并有坏死组织堆积及感染。7 d时bFGF组伤口周边有大量成纤维细胞增生，血管减少。对照组明显水肿，炎性细胞浸润，边缘有部分口腔粘膜上皮长入。10 d时bFGF组皮下结缔组织相连，口腔粘膜上皮结构完整，近鼻腔侧鼻粘骨膜将鼻粘膜缺损修复，伤口愈合。而对照组组织充血水肿，部分区域见炎性细胞浸润，口腔上皮沿创口边缘向鼻腔方向长入，穿孔无法修复。四、嗜银染色观察结果核仁形成区嗜银蛋白染色(AgNORs)显示：bFGF组第5 d时成纤维细胞中AgNORs颗粒数为3.7

14、3±0.52，显著高于对照组2.11±0.31(P0.05)。Fig 1At3 days there were many macrophagocytes in bFGF group(6.7×10)13d时实验组有大量巨噬细胞出现Fig 2At3 days there were many inflammatory cells infiltrating into tramatic region in control group(6.7×10)23d时对照组创口处有大量的炎性细胞浸润Fig 3At5 days quantity of fibroblasts w

15、ere increased,nuclei changed latgely and cell plasma were rich in bFGF group(6.7×40)35d时实验组中成纤维细胞数量增多、胞核大且胞浆丰富Fig 4At5 days quantity of fibroblasts were less and nuclei were small in control group(6.7×40)45d时对照组成纤维细胞数量少、核小讨论有学者在小鼠实验中发现，bFGF能有效地促进一系列细胞参与炎性反应，使巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞增多，有利于肉芽组织生长和加速伤

16、口愈合的作用58。本研究发现,bFGF在早期就具有明显促进创面巨噬细胞成熟和数量增多的作用，因而有助于早期清除伤口附近的坏死组织、吞噬病原菌以及肉芽组织的生长。 肉芽组织是由植入于疏松胶原、纤维结合素和透明质酸基质中的大量成纤维细胞、巨噬细胞和新生脉管系统所组成。成纤维细胞的分化与成熟，会直接影响肉芽组织的功能发挥。研究表明9：外源性的bFGF可以使创伤部位的成纤维细胞增殖，促进胶原分泌以及肉芽组织基质的合成功能，并经历一系列过程变成肌纤维细胞的表型变化，而后与其它细胞及细胞外基质相互影响并产生收缩力，以助伤口闭合。因而成纤维细胞在创伤愈合过程中起着重要作用。本实验结果显示：外源性bFGF在早

17、期就能够使成纤维细胞数量增多，细胞内蛋白质合成旺盛, 肉芽组织生长迅速。提示成纤维细胞在bFGF的作用下数量增多、功能活跃，有促进肉芽组织的生长与创口愈合作用。AgNORs染色技术，已广泛应用于肿瘤病理学中良恶性病变的鉴别，现已证实4：AgNOR在时间、空间与数量上均与rRNA基因活性有关，AgNORs数量与构型的变化反映细胞活性。本文结果显示：在bFGF治疗早期，成纤维细胞中AgNORs颗粒数目明显多于对照组。提示bFGF能够刺激创面中成纤维细胞增殖，促进肉芽组织快速生长，加速伤口的愈合。综上所述，bFGF能促进早期腭裂穿孔创面巨噬细胞成熟和数量增多的作用，同时也能够促使成纤维细胞的活跃和增

18、殖。由于肉芽组织的在bFGF作用下快速生成，其生长的速度要快于口腔上皮的生长速度，从而使快速增长的肉芽组织在穿孔部位的迅速融合，实现穿孔的愈合。孔卫东（暨南大学医学院 第一附属医院口腔科， 广东 广州 510630）林巍（暨南大学医学院 第一附属医院口腔科， 广东 广州 510630）李小兰（微生物与免疫学教研室）沈丽佳（口腔系）邓国珍（口腔系）参考文献1石冰. 腭裂术后瘘孔的临床研究进展J. 国外医学口腔医学分册，1999,25(3):174176.2Folk SN, Antinio LL, Hardestry KA, et al. Secondary cleft deformitiesJ.

19、 Clin Plast Sury, 1997, 24(3): 599611.3孔卫东，林 巍，沈 山. 碱性成纤维细胞生长因子治疗腭裂术后穿孔的临床观察J. 临床口腔医学杂志，1999,15(3):176178.4沈丽佳，陈嘉铭，蔡国藩，等. 涎腺腺样囊性癌银染核仁形成区的定量研究J. 暨南大学学报, 1994, 15(4)：3336. 5 Murata M,Hara K,Saku T. Dynamic distribution of basic fibroblast growth factor during epulis formation: an immunohistochemical study in an enhanced healing process of the gingivaJ. J Oral Pathol Med, 1997,2