实验十pUC57T载体的制备

1、实验十 pUC57 T 载体的制备一原理PCR 产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上 的一些技术问题可能限制其应用。由于PCR产物3'末端突出一个 A,因此克隆PCRT物的载体3'末端必须突出一个 T,这样载体与PCR产物之间形成粘性长端。现在许多公司开发 出了此类专用于 PCR产物克隆的T载体。本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv,用Taq酶将其3'末端加上T,然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接。用凝胶电泳将自身 环化的质粒与3'末端带有T.不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57T 载体。二

2、方法1 .制备pUC57质粒DNA (见实验一)2 .用EcoR V酶解pUC57 DNA (见实验九)3 .在酶解的pUC57 DNA末端加上 T。取一支 0.5ml 微离心管.加入：EcoR V 酶解的 pUC57 DNA 10 卩 g10 X PCR缓冲液15卩ldTTP 10mmol/ L20卩 lTaq DNA聚合酶（5U/卩l） 1 卩l ddH?O to150l 10 000r/min 离心 5s 混匀，72C水浴 2h。4. DNA片段的纯化(1) 在上述0.5ml微离心管中加入等体积(15卩l)酚/氯仿混匀，放置数分钟，5 000r/min 离心5min.使液体分层。(2)

3、吸收酚/氯仿抽捉提之水相至另一 1.5ml 离心管中，加入 1/10 体积的乙酸钠，加 2 倍体积冷无水乙醇，混匀。 -20 C冰箱放置2h, 15 000r /min离心15min。(3) 倾去乙醇，加入 70冷乙醇淋洗。(4) 倾去乙醇，滤纸吸干，真空抽吸23min。(5) 加人30卩l ddH 2O,溶解 DNA5. 载体DNA自身连接在DNA片段纯化管中，加入 5卩l 10x连接酶缓冲液和2 UT4 DNA连接酶，并用重蒸水补至总 体积50卩l。16C连接16小时。6. 琼脂糖凝胶电泳将DNA连接液在I % (Wt/ V01)琼脂糖凝胶上电泳分离 pUC57 T载体和原载体7. pUC

4、57 T载体的纯化用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性载体，井用电泳对此载体进行定量。110mmol/L dTTP。2. Taq DNA聚合酶，5U/ 卩 l3酚/氯仿。4.乙醇放置-20 C冰箱保存备用。5乙酸钠， 670%冷乙醇7 ddH2O。8琼脂糖。9. T4DNA连接酶。1010X 连接酶缓冲液。11溴酚蓝指示剂12. EB溶液13琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒四说明本实验是一个典型的将具有平齐末端的线性DNA片段变成粘性片段的方法。在基因工程过程中经常要将平齐末端转变为粘性末端或要将粘性末端转变为平齐末端，除了本实验中 的方法外还有下列方法：1 在平齐末端产生新限制性内切酶位点的方法

5、(1) 试剂 T4 DNA连接酶 10xT4 DNA连接酶反应缓冲液300 mmol L Tris-HCI ， pH7.8100 mmol L MgCl 2100 mmol L DTT10 mmol L ATP注：IOX连接酶缓冲液应-20 C保存。不要多次冻存和融化。连接缓冲液中ATP降解连接反应失败的最常见原因。 磷酸化限制酶接头 无核酸酶重蒸水 限制性内切酶及其缓冲液 氯仿：异戊醇(24 : 1)TE 缓冲液10 mmoI L Tris HCII mmoI L EDTA酚：氯仿：异戊醇 (25 ： 24： 1)混合等体积的TE缓冲液与重蒸酚，分层后，再将 1份下层酚相与1份氯仿：异戊醇(

6、24 : 1) 混合即可。(2) 原理限制酶接头是合成的 DNA双链，含有限制性内切酶识别序列，可用于将一个新的限制 性内切酶位点加入到含平端的DNA片段上。商品化的接头有5'末端磷酸化和非磷酸化两种。磷酸化的接头更适于本实验.因为T4 DNA连接酶需要一个 DNA模板5'末端含磷酸基团。使用磷酸化的接头可以与非磷酸化的载体连接，这样可以降低载体自身重新连接的背景。(3) 方法 取一微离心管，分别加入：10 X T4 DNA连接酶反应缓冲液1 卩IDNA(100 500ng)1卩 I磷酸化限制酶接头超过DNA片段的摩尔数100倍T4 DNA 连接酶 (Weiss 单位 )2.5

7、 u加无核酸酶蒸馏水至I0卩I* 注：1卩g Ikb DNA片段约为1 . 52pmol.商品限制酶接头常以 A260度量对于10碱基的 限制酶接头， 0.015A 260 的量相当于大约 152pmol DNA。 15 C反应618小时。 70 C加热10分钟终止反应。 立即在冰上冷却反应管，用相应的限制性内切酶进行酶解， 酶解后，加等体积酚：氯仿：异戊醇 (25 : 24： 1)到反应管中提取 DNA振摇I分钟， 12 000g 离心 5分钟。 转移上层水相至另一新离心管中.为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。 加等体积氯仿；异戊醇 (2J1 : 1)，振摇30秒，12 OOOg

8、离心2min,移上层水相至另 新管中。 用琼脂糖凝胶电泳除掉未连接的限制酶接头片段，从胶中川收DNA片段。2 .将 5'突出末端转变为平端的方法(1) 试剂 ' 无核酸酶重蒸水 限制性内切酶及其缓冲液 氯仿：异戊醇(2 /1: 1) TE缓冲液10 mmoI L Tris-HCII mmoIL EDTA 酚：氯仿；异戊醉(24:1) 3mol / L乙酸钠，pH5. 2 无水乙醇 70%乙醇 DNA聚合酶大片段(Kle now) 10XDNA聚合酶Klenow片段缓冲液500 mmol L Tris HCl, pH7. 2100 mmol L MgSO4l mmol/L DTF

9、(11) T4 DNA聚合酶(12) 10 x T4 DNA聚合酶缓冲液330 mmol L Tris 乙酸 pH 7.9660 mmol L 乙酸钾100 mmol / L乙酸镁5 mmol L DDT(13) 乙酰化牛血清白蛋白，1 mg / ml(14) dNTPs 100 mmol / L(2) 原理Klenow(DNA聚合酶大片段)及T4 DNA聚合酶都能利用 dNTPs补齐5'突出末端(3) Klenow 聚合酶法 酶解DNA形成5'突出末端。 加等体积酚：氯仿：异戊醇 (25 : 24： 1)到反应管中提取 DNA振摇1分钟，12 000g 离心 5分钟。 转移上

10、层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。 加0.1体积3mol/L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或-20 C放置1530分钟，沉淀DNA。 4 C 12 OOOg离心10分钟.如果 DNA浓度较低，小于 100ng/m1,离心时间为 30分钟 这样可增加DNA勺回收率。注：小量DNA勺回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50卩g/ml,而改进回收效果。如果 tRNA会影响以后DNA勺应用，也可使用糖原。 离心弃上清.加 200卩I 70 %乙醇。12 OOOg 4 C离心5分钟。 小心移去上清，空气中干燥沉淀。 用含：40卩mol/L每种dNTP及

11、0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋的I倍Klenow酶缓冲液 溶解DNA每微克 DNA加入1u lqenowDNA聚合酶。总反应体积在 10 一 100之间均可。Klcnow DNA 聚合酶在许多限制酶反应缓冲液中(如Promemt的核心缓冲液)有一定活性。这样可直接将酶及 40卩mol/L每种dNTP加入到限制酶反应后的反应管中，省略以上的 步。将反应管置室温中反应 10分钟 75 C作用10分钟终止反应。T4DNA聚合酶法 采用 Klenow 聚合酶法的一步骤纯化DNA。 用含100卩mol/ L每种dNTP和0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶反应缓冲液溶解DNA每微克

12、DNA加5u T4DNA聚合酶 75 C作用10分钟终止反应。3 .将3'突出末端转变为平端的方法(1) 试剂 无核酸酶重蒸水 限制性内切酶及其缓冲液 氯仿：异戊醇(24 : 1) TE缓冲液lO mmol /L Tris HCIl mmol /L EDTA 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1) 3mol/ L乙酸钠，pH5. 2 无水乙醇 70%乙醇 T4 DNA聚合酶 10 x T4 DNA 聚合酶缓冲液330 mmol /L Tris 乙酸， pH 7. 9660 mmol / L 乙酸钾100mmol /L 乙酸镁1 mmol /L DTT(11) 乙酰化牛血清白蛋白(12) d

13、NTPs 100 mmol / L(2) 原理在过量dNTP存在下T4 DNA聚合酶具有3' 一 5,核酸外切酶活性，能将3,突出末端转变为 平齐末端。(3) 方法 酶解DNA形成3'突出末端。 加等体积酚：氯仿：异戊醇 (25 : 24： 1)到反应管中提取 DNA振摇1分钟，12 000g离心5 分钟。 转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。 加0体积3mol / L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或 -20 C放置1530分钟，沉淀 DNA。 4 C 12 000g离心10分钟，如果 DNA浓度较低，小于100ng/ml，离心时间为 30

14、分钟， 这样可增加DNA的回收率。注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达 50卩g/ ml而改进回收效果。如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原。 离心弃上清，加 200卩l 70 %乙醇，12 000g 4 C离心5分钟。 小心移去上清，空气中干燥沉淀。 用含100卩mol/ L,每种dNTP及0.1mg/ ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶缓冲液溶解DNA 0.25卩gDNA的反应体积为 20卩l，每微克DNA加5u T4DNA聚合酶。37C反应5分钟。注：高浓度的dNTPs(100卩mol/ L)将使DNA的降解终止在双链 DNA处，。然而，如果 dNTPs含量太低，TIDNA聚合酶的外切酶活性则很高.可使双链 DNA降解。在本反应中，所 有4种dNTP都必须有。 75C作用10分钟，终止反应：4. 部分补齐 5，突出末端的方法对上