-质粒DNA的提取及定量定性分析ppt课件

1、Q&A 关于关于PCRPCR结果分析结果分析 关于产物回收关于产物回收漂洗作用：换缓冲液，除杂漂洗作用：换缓冲液，除杂乙醇：保管目的产物乙醇：保管目的产物离心：去乙醇，除液体，保证后续任务离心：去乙醇，除液体，保证后续任务补救：勿随便弃置；补救：勿随便弃置； 高盐结合，反复漂洗。高盐结合，反复漂洗。 关于关于 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products.Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker from top

2、to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp引物或其二聚体引物或其二聚体问题：问题：10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？启动不够？ 回收，重新电泳鉴定。回收，重新电泳鉴定。1、12泳道：未加引物或模板。泳道：未加引物或模板。相邻泳道溢出污染相邻泳道溢出污染非特异性！非特异性！Good边缘效应？边缘效应？！胶融！外溢胶融！外溢胶融！胶融！质粒质粒DNADNA的提取的提取及其定性定量分析及其定性定量分析 主要内容主要内容一、质粒一、质粒DNADNA提取提取二、琼脂糖电泳鉴定及半定量二、琼脂糖电泳

3、鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测三、紫外吸收定量及纯度检测根本原理根本原理 构造差别构造差别 分子量差别分子量差别 变性复性变性复性SDS碱裂解碱裂解碱裂解碱裂解 碱变性碱变性一、质粒一、质粒DNADNA的提取流的提取流 程程接含接含pETBlue-2(pETBlue-2(质粒的单菌落于质粒的单菌落于4mL LB 4mL LB 羧苄羧苄50ug/mL 50ug/mL 和四环素和四环素12.5ug/mL12.5ug/mL液体培育基中液体培育基中370C370C，190rpm190rpm振荡培育过夜振荡培育过夜4000rpm4000rpm、离心、离心1min1min，搜集一切菌体，搜集一切菌

4、体150uL150uL溶液溶液I I悬浮菌体旋涡混匀，室温悬浮菌体旋涡混匀，室温10min10min参与参与200uL200uL溶液溶液IIII悄然混匀悄然混匀! !，室温静置菌液裂解变清，室温静置菌液裂解变清 接菌接菌培育培育收菌收菌碱裂解碱裂解参与参与200uL200uL溶液溶液IIIIII悄然混匀悄然混匀! !，冰上静置，冰上静置15min15min质粒质粒DNADNA复性复性12000rpm12000rpm，离心，离心10min10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇旋涡混匀上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇旋涡混匀12000rpm12000rpm，离心，离心5min5min上清加等体积的

5、氯仿：异戊醇旋涡混匀上清加等体积的氯仿：异戊醇旋涡混匀12000rpm12000rpm，离心，离心5min5min复性回收复性回收纯化纯化上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇旋涡混匀，室温倍体积的无水乙醇旋涡混匀，室温 30min30min12000rpm12000rpm，离心，离心10min10min沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1mL1mL洗涤两次振荡混匀、离心洗涤两次振荡混匀、离心12000rpm12000rpm，离心，离心5min5min沉淀于超净台中风干沉淀于超净台中风干5min5min20min20min沉淀参与沉淀参与20uL RTE20uL RTE，600C600C水浴水浴30

6、30分钟溶解分钟溶解-200C-200C保管保管醇沉回收醇沉回收溶解溶解保管保管离心离心标识标识碱裂解碱裂解溶液溶液冰浴冰浴pH 8.0pH 8.0猛烈振荡猛烈振荡10 min10 min溶液粘稠混浊溶液粘稠混浊碱裂解碱裂解溶液溶液现用现配现用现配切勿振荡！颠倒混匀切勿振荡！颠倒混匀T 5minT 5minSDSSDS包被包被 ！复性回收复性回收溶液溶液冰上预冷冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀切勿振荡！颠倒混匀15min15min仅质粒复性？在哪相？仅质粒复性？在哪相？ ！制制 胶：胶：1%1%琼脂糖琼脂糖20 mL20 mL，1xTAE)1xTAE)缓冲液：缓冲液：1xTAE1xTAE，130 m

7、L130 mL制制 样：质粒样：质粒DNA 2L DNA 2L 10 xloading 0.5L 10 xloading 0.5LMarkerMarker：5L5L电电 泳：泳：8080伏恒压伏恒压结果分析：鉴定定性，纯度；半定量结果分析：鉴定定性，纯度；半定量二、质粒二、质粒DNA的电泳的电泳测定流程：质粒测定流程：质粒DNADNA稀释稀释100100倍用倍用TETE缓冲缓冲液稀释，总体积液稀释，总体积300 L300 L检测波长：检测波长：定量：定量：C=OD260C=OD260* *5050* *稀释倍数稀释倍数 g/mL g/mL 纯度目的：纯度目的：三、质粒三、质粒DNA的紫外吸收检测的紫外吸收检测260nm260nm核酸核酸280nm280nm蛋白蛋白 OD260/OD280 OD260/OD280比值范围：比值范围：1.81.82.02.0污染成分：蛋白污染成分：蛋白, ,酚酚 质粒质粒DNA RNADNA RNA下次实验的简介与预备下次实验的简介与预备DNA DNA 重重 组组酶切和衔接酶切和衔接 预习：在实验中如何进展对照？预习：在实验中如何进展对照？ 思索：工程菌的常用种类及用途？思索：工程菌的常用种类及用途？ 质粒的种类及特性？质粒的种类及特性？ 分子生物学中常用的内切酶？衔接酶？分子生物学中常用的内切酶？衔接酶？ 抗生素种类？为什么运用抗生