参龙煎剂对肺纤维化肺组织形态学影响的实验研究

1、    参龙煎剂对肺纤维化肺组织形态学影响的实验研究【摘要】 目的：观察参龙煎剂对博来霉素致大鼠肺纤维化的防治作用。 方法 ：将大鼠按照性别、体重随机分为空白组、模型组、泼尼松组（5.4mg/kg）、参龙煎剂低剂量组（生药量0.675g/ml）、参龙煎剂中剂量组（生药量1.2g/ml）、参龙煎剂高剂量组（生药量2.4g/ml）。按照BLM5mg·kg1体重复制大鼠肺纤维化模型。24小时后给药，观察各实验组7天、14天、28天肺组织病理形态表达情况的变化。结果：参龙煎剂 治疗 后模型大鼠肺部炎症浸润情况减轻、肺泡破损减轻、胶原沉积减少。结论：结果

2、表明，证实了参龙煎剂能够改善肺纤维化的异常组织结构，使延缓肺纤维化的病程成为了可能。 【关键词】 肺纤维化 HE染色 Masson染色肺纤维化是一组病因各异、表现相似的疾病谱，其病理主要表现为早期的炎症细胞浸润、肺组织损伤，晚期的细胞外基质及胶原沉积和肺组织结构的重塑1。许多 研究 表明，肺纤维化初期肺组织病 理学 改变以肺炎症浸润为主，大量的炎症细胞浸润，肺组织充血、肿胀，后期则以胶原纤维增生为主，大量胶原纤维代替正常组织，使肺组织破坏、功能丧失23。本实验旨在观察参龙煎剂即通过补肺益肾、祛瘀通络法对肺纤维化作用机制进行探讨。通过对各组大鼠的一般状态、病理形态的比较来说明参龙煎剂对博莱霉素引

3、起的机体系统脏器损伤和一般功能状态的损害有一定的保护作用。1 资料1.1 实验动物健康Wistar大鼠216只：雌雄各半，体重180210g，由沈阳医学院动物实验中心提供（动物许可证号：SCXK（辽）2003-0016），按清洁级标准饲养。1.2 实验药品盐酸平阳霉素（BLM）：哈尔滨博莱制药有限公司生产，国药准字：H23021807，批号06060201，8mg/支。参龙煎剂：辽宁中医药大学附属二院制剂室制备，主要成分由黄芪、沙参、当归、川芎、熟地、地龙、甘草等中药组成。醋酸泼尼松片：国药准字H12020698，产品批号051108。5mg/片，天津天药药业股份有限公司。1.3 主要试剂及仪

4、器万能显微镜（日本 OLYMPUS 公司）BI-2000图像 分析 系统（成都泰盟 科技 有限公司）；HE染色、Masson染色试剂（ 中国 医药上海化学试剂公司）。2 实验方法2.1 动物模型制备参照Szapiel4方法，将大鼠麻醉，暴露气管，一次性注入BLM注射液（5mg·kg1），左右旋转鼠板，使BLM注射液均匀分布于两肺，制成模型。2.2 实验动物分组及给药方法实验动物按雌雄、体重分层随机分为6组，每组36只，每天灌胃一次，每周复查体重，调整给药量。共饲养4周，分别于7天、14天、28天3个时间点取材，每次处死12只动物。分组：正常对照组、模型组、泼尼松组（5.4mg/kg）

5、、参龙煎剂低剂量组（生药量0.675g/ml）、参龙煎剂中剂量组（生药量1.2g/ml）、参龙煎剂高剂量组（生药量2.4g/ml）。正常组、模型组建模后第2日起每日予以1ml/kg生理盐水灌胃。其余各组按配好的药品以等容药品灌胃。2.3 标本的制备 腹主动脉放血至死，剖开胸腔和颈部，分离气管和肺脏，取下肺叶，用冰盐水洗去血渣，剔除结缔组织，滤纸吸干。称重后，同时结扎右主支气管，从肺门部离断，右肺上叶用定量输液泵小心灌入含有1/1000DFFC4%多聚甲醛溶液在25cmH20压力下进行灌注固定，切成1.5×1.5×1cm3大小，30分钟后投入多聚甲醛溶液固定一周。取固定好的组

6、织，在横颈最大处3mm后组织片，常规脱水，二甲苯透明，用自动石蜡包理机。切面4um的切片。备做HE、MASSON染色、光学显微镜下观察。2.4 病理形态学定量分析用BI-2000图像分析系统对HE染色病理切片进行光密度（OD值）测定。扫描时将切片分为3个区域：肺泡腔内无组织结构，OD值最低，定为无染区，其面积代表肺泡腔的面积；细胞核的OD值最高，定为深染区，其面积反映炎症细胞浸润程度；细胞外基质和炎症渗出染色较细胞核浅，HE切片中为粉色或浅粉，定为浅染区，与肺泡炎阶段炎性水肿和渗出的区域基本一致，在模型晚期其面积主要反映细胞外基质沉积程度。将切片置于图像扫描分析仪显微镜下，在放大200倍条件下

7、，每张切片分别从四周和中间随机选5个视野，测定深染区、浅染区和无染区所占的面积。2.5 利用HE染色的病理切片，确定肺泡炎等级判定方法病变程度确定根据Szapiel等4的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为四级：（）无肺泡炎；（+）轻度肺泡炎，单核细胞浸润面积20%，结构正常。（+）中度肺泡炎受累面积20%50%。（+）重度肺泡炎，受累面积50%。2.6 利用Masson氏三色染色的病理切片，确定肺纤维化等级判定 方法 根据Szapiel等4的方法，分为四级：0级：无肺间质纤维化（）；1级：轻度肺间质纤维化（+），病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺间质纤维

8、化（+），病变范围占全肺20%50%，肺泡结构紊乱。2.7 统计学方法统计数据 应用 SPSS11.0统计软件单因素方差 分析 （one Way Anova），统计结果用（x±s）表示。3 实验结果3.1 肉眼观察肺组织外观形态正常组大鼠双肺呈淡红色，表面光滑，灌洗时弹性好，未见出血点。7天时，造纤维化模型各组均有明显增大，质地坚硬，颜色鲜红，并见肺组织轻度充血，表面出血点增加，以模型组最为严重。14天、28天后，模型组表现双肺体积略缩小，质地硬，颜色暗红，表面粗糙不平，可见小片状、凸凹不平苍白灶，灌洗时弹性减弱，表面出血点散在，并见瘀斑。参龙煎剂各组肺组织颜色粉红色，表面略粗糙，灌

9、洗时弹性尚好，体积无明显缩小，偶见出血点。激素组肺组织呈粉红色，表面光滑，灌洗时弹性好。3.2 肺组织病理形态观察HE染色可见各造模组均有程度不等的肺泡炎，肺泡腔及肺间质内有不等的炎性细胞浸润，以巨噬细胞、淋巴细胞及少量的中性粒细胞为主，模型组最明显，而参龙煎剂中剂量组 治疗 效果最好。（见图2）MASSON染色中造模各组肺间质、支气管壁和肺泡隔胶原染色中胶原纤维明显增多，以模型组最多。7天时胶原纤维主要分布于细小支气管及小血管周围，肺泡间质散在的胶原纤维，胶原纤维较短，尚未形成片状及束状；14天时，小气管、小血管胶原纤维明显增多，支气管偶见少量束状胶原纤维，肺间质胶原纤维呈束状或小片状分布；

10、28天时，支气管、小支气管、小血管大量胶原纤维环绕，周围胶原增生并向肺间质延伸在间质沉积，呈片状、束状，但治疗组病变程度均要比模型组轻。3.3 各组大鼠不同时间点HE切片深染区比较情况结果显示：HE染色病理切片深染区面积代表炎性浸润：正常组大鼠各个时间点的深染区面积明显小于其它各组。P0.05或P0.01；模型组炎性浸润随时间的推移，逐渐减低，各个时间点都大于中剂量和激素组有明显的差异，P0.05或P0.01；参龙煎剂各个剂量组深染区的面积也有逐渐减少的趋势，且以中剂量增加减少幅度最大，14天、28天与高剂量、低剂量有统计学意义P0.05，且与激素组效果相似；各个时间点参龙煎剂各个剂量均呈量效

11、关系趋势（见表1、图1）表1 各组大鼠不同时间点HE切片深染区比较（略）注：P0.05 compared with N；P0.01 compared with N；P0.05 compared with M；P0.01compared with M；P0.05 compared with MD。3.4 肺泡炎、肺纤维化分级比较（见表2）。表2 各个时间点肺泡炎及肺纤维化分级比较（略）4 讨论肺部的病理组织形态改变是最直观的疗效衡量标准。实验结果表明，模型组大鼠肺脏从外观可见明显的充血、水肿、瘀点瘀斑、肺组织明显增大、质硬，而参龙煎剂各组肺组织形态明显好于模型组。肺组织轻度充血、水肿，肺组织增大

12、、质略硬。与激素组比较，色泽较深、较粗糙、较大。从光镜检测结果可见，模型组肺组织可见明显的炎症及纤维化的改变，早期大量炎性细胞浸润，肺组织大量充血、水肿；晚期，纤维化沉积。参龙煎剂组肺部病变程度显著减轻、病变范围局限。无论是外观还是光镜下的检测情况，均可见肺泡炎和纤维化，这证明了参龙煎剂对肺纤维化有积极的干预作用，从而表明了其可靠的治疗效果。病理形态半定量分析，把切片从整体上进行平均炎症浸润程度、纤维化程度及正常肺组织面积来判定。经参龙煎剂治疗的大鼠的肺泡腔面积显著增加（即无染区增加）而代表肺泡炎的深染区面积和代表纤维沉积的浅染区面积明显减少，在各个时间点与模型组差异显著。肺组织的等级资料分析

13、，是对肺泡炎及纤维化个数判定的指标。通过分析，模型组多呈中、重度肺泡炎或纤维化改变，而参龙煎剂各个剂量组合激素组则多呈轻、中度肺泡炎或肺纤维化改变，与激素组比较无明显差异。通过这两种方法的分析，可能说明了参龙煎剂起到了抑制肺泡炎的加重，抑制了胶原纤维的沉积，减缓了肺纤维化的进程，减轻了肺纤维化的病变程度。5 小结 目前 ，我们所采用的方法复制出的只是一种药物性肺纤维化，不论从发病机制还是疗效评价，都有一定的局限性，且样本较小，治疗时间短，还不能全面、充分的反映出临床上的错综复杂的情况。在今后，自发性动物疾病近似于人类疾病，所以要大力开展自发性动物模型的探寻工作。现在，中医药的治疗尚在初步阶段，

14、并且有很好的前景，相信在今后我们能充分利用中医的优势来对自发性动物模型进行 研究 实验。【 参考  文献 】1 Crystal RG,Bitterman PB,Rennerds letal .interstitial lung diseases of causes:disorders characterized by chronic inflammation of theolwer respiratory tract.N EI Jmed :1984,310:154166.2 赵洪文，彭 璐肺纤维化大鼠BALF中细胞成分和肺组织病理的动态研究J 中国 医科大学学报，1997，26（5）：4634663 柴文戌，李永春，刘玉玲，等博莱霉素大鼠致肺纤维化形态学变化的实验研究J中国实验动物学报，2003，11（2）：77804 Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-