低强度红激光局部照射抑制血管成形术后血管重塑的可能机制

1、    低强度红激光局部照射抑制血管成形术后血管重塑的可能机制        【摘要】目的观察低强度红激光照射(Low Power Red Laser Irradiation, LPRLI)后局部血管组织型胶原(Col )mRNA、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达和血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡，探讨LPRLI抑制动脉粥样硬化兔血管成形术后收缩性血管重塑的可能机制。方法建立动脉粥样硬化兔的血管损伤模型。100只新西兰白兔随机分为单纯血管拉伤组和单纯拉伤+激光照射组。对

2、术后3天、1周、2周、4周、8周动物组织提取总RNA、半定量RT-PCR观察ColmRNA表达和免疫组织化学-LSAB法测定ICAM-1、p53、bcl-2/bax。TUNEL法检测VSMC凋亡并计算凋亡指数。结果Col mRNA的表达：术后3天，两组均可见到ColmRNA的表达，但无统计学意义；术后第14周，ColmRNA的表达LPRLI组明显低于对照组；第8周，两组ColmRNA的表达均减弱，组间无统计学差异。ICAM-1的表达：免疫组织化学检测术后3天即可看到ICAM-1的表达，LPRLI组明显低于对照组；第1周到第4周，LPRLI组的ICAM-1虽然逐渐增强，但仍然显著低于对照组，并可

3、见到血管外膜明显表达ICAM-1,LPRLI组位于外膜的ICAM-1的表达受到明显抑制。VSMC凋亡的检测：我们用TUNEL法检测了位于损伤血管内膜和中膜的VSMC的凋亡，结果发现术后3天至1周两组间凋亡指数无统计学意义；术后2周至4周，LPRLI组VSMC的凋亡指数明显大于对照组；第8周两组间无统计学意义。p53、bcl-2bax三个凋亡相关基因的检测组间未发现明显统计学差异。结论LPRLI可以抑制ColmRNA的表达；LPRLI抑制炎症反应可能是通过抑制ICAM-1的表达来实现；LPRLI可以诱导损伤血管VSMC凋亡并且与p53,bcl-2/bax三个凋亡相关基因的表达无关，LPRLI诱导

4、VSMC凋亡的确切机制尚需进一步研究。以上三个结论可能成为LPRLI抑制损伤血管收缩性重塑的重要机制。【关键词】激光血管重塑凋亡平滑肌细胞 The potential mechanisms of LPRLI attenuates the constrictive vascular remodeling after balloon injury in atherosclerotic rabbitsGeng QingshanFeng JianzhangChen Jiyan（Department of Cardiology, Guangdong Cardiovascular Institute, G

5、uangzhou 510100）【Abstract】ObjectiveIn this study, we investigated whether LPRLI (Low Power Red Laser Irradiation) could attenuate the expressions of Col I mRNA, ICAM-1, p53,bcl-2/bax and induce apoptosis of VSMC in the rabbit abdominal aorta injury model. MethodsWe established atherosclerotic arteri

6、al stenosis models successfully. 100 male New Zealand white rabbits were randomized into two groups: balloon injury group and balloon injury plus laser irradiation group (total irradiation density:0.9J/cm2). After 3 days, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, abdominal aortas were harvested for reverse

7、 transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) studies and immunohistochemical studies on the expressions of Col I mRNA, ICAM-1, p53,bcl-2bax. The presence of apoptotic VSMC was demonstrated by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickl end labeling (TUNEL) method. ResultsThe expre

8、ssion of Col I mRNA at 3rd day after balloon injury, the two groups (LPRLI group vs control group) did not show a significantly difference (114±24） cpm vs （118±11）cmp, P0.05. from 1st week to 4th week, the expressions of Col I mRNA showed a significantly difference. The densitometric data

9、of RT-PCR in LPRLI group was lower than the control group (760±119） cpm vs （879±121） cpm, P0.05；（1 120±300） cpm vs （1 409±297） cpm, P0.05; （918±180） cpm vs （1 109±117） cpm, P0.05；The expression of ICAM-1 from 3rd day to 4th week, the expressions of ICAM-1 in LPRLI group

10、 was significantly reduced both at the intima and adventitia (0.90±0.48） vs （1.79±0.91）, P0.05；（1.41±0.89） vs （3.46±1.57）, P0.01; （2.60±0.91） vs （3.51±0.99）, P0.05；（2.31±1.00 ）vs （2.57±1.20）, P0.05.Apoptosis of VSMC. These studies suggested that there were his

11、tochemical evidence of apoptosis in all of the injured vessels. There were no quantitative differences in the amount of LPRLI and control vessels at 3 days, 1 week and 8 weeks. But there were marked differences between the two groups. The index of apoptotic VSMC in LPRLI group was higher than contro

12、l groups (51±19 vs 29±11,P0.01;36±12 vs 26±8,P0.05). No significantly differences of apoptotic related gene expression were found in the two groups include p53, bcl-2/bax. ConclusionThese preliminary findings suggest that LPRLI prevents vascular lesion formation after balloon inj

13、ury by reducing the expressions of Col I mRNA and ICAM-1. In addition, LPRLI may contribute to induce the apoptosis of VSMC. The results of this study support that LPRLI is a very useful technique in controlling the constrictive vascular remodeling by reduction of vessel constriction and inhibition

14、of inflammatory reaction. It should attract attention as a possible approach to reduce coronary restenosis. 【Key words】Laser Vascular remodeling Apoptosis VSMC血管重塑(vascular remodeling)是血管受血流动力学和体液因素的影响使其形态结构和功能发生适应性改变的过程。血管重塑在再狭窄的发生和发展中起重要作用。低强度红激光照射(Low Power Red Laser Irradiation, LPRLI)在球囊成形术后通过抑

15、制病理性重塑来预防再狭窄的发生已被大量临床研究和实验研究所证实，本文在充分肯定LPRLI这一序效的基础上，试从LPRLI对血管损伤后所发生的非特异性炎症反应、胶原代谢、VSMC增殖和凋亡等方面探讨LPRLI影响球囊成形术后血管重塑的可能机制。材料与方法1.实验动物处理与取材：雄性新西兰白兔100只，随机分为单纯球囊拉伤组和球囊拉伤+激光照射组，每组按实验终点(3天、1周、2周、4周、8周)的不同随机分为5个亚组，从术前1周开始给予高脂饮食至实验终点。用PTCA球囊导管拉伤右髂动脉和腹主动脉各20 mm，建立动脉粥样硬化兔的血管损伤模型。激光照射组于球囊拉伤后应用Global Therapeut

16、ic公司生产的激光球囊导管(laser balloon 3.0×20 mm)和激光发生器(He-Ne laser)经光导纤维向血管内导入低强度红激光，对损伤血管进行局部照射，激光发生器输出功率10 mW，照射时间1 min×3次，每次间隔1 min，光斑面积1.884 cm2，能量密度0.9 J/cm2。于各实验终点处死动物，留取拉伤段腹主动脉和邻近正常血管。2.损伤血管型胶原(collagen type,Col)基因表达的检测：血管总RNA的提取：提取试剂盒为QIAGEN公司产品，具体步骤省略；逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)：参考有关文献1合成本实验所用基因引物序列

17、(见附表)。逆转录及扩增条件为60逆转录20 min94 1 min55 1 min72 1 min，共39个循环，最后一次循环在72停留7 min，以保证引物继续延伸。反应完毕取反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，在凝胶成像分析仪中观察分析。附表RT-PCR靶基因引物序列靶基因引物产物(bp)Col senseantisense5GGCGGCCAGGGCTCCGACCC-35-AATTCCTGGTCTGGGGCACC-33473.损伤血管细胞间黏附分子(ICAM-1)表达的检测：损伤血管ICAM-1表达的检测采用免疫组织化学-LSAB法，试剂盒为丹麦DAKO公司产品。第

18、一抗体的稀释滴度为1500。对照切片包括以正常兔IgG代替第一抗体进行孵育的替代对照和不加第一抗体的空白对照。ICAM-1的检测结果根据染色强度进行积分：0分，即细胞中无棕色的ICAM-1颗粒；1分，阳性细胞数25%；2分，阳性细胞数26%50%；3分，阳性细胞数51%75%；4分，阳性细胞数75%。4.VSMC凋亡及其凋亡相关基因的检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法，试剂盒为德国Bochringer Nannheim公司产品。用免疫组织化学-LSAB法检测p53、bcl-2/bax三个凋亡相关基因，方法同上。5.统计学处理：所有数据均以均数±标准差表示。两组数据之间的

19、比较用t检验，ICAM-1免疫组织化学检测结果的比较用秩和检验，P0.05为差异具有显著性。 结果1.损伤血管型胶原mRNA表达的动态变化：本研究用RT-PCR法观察了血管损伤后第3天至第8周ColmRNA的变化，结果术后3天，两组均可见到ColmRNA的表达，但无统计学意义(114±24) cpm vs （118±11）cpm, P0.05。术后第14周,ColmRNA的表达LPRLI组明显低于对照组(760±119）cpm vs （879±121）cpm,P0.05;（1120±300）cpm vs （1409±297）cpm,P

20、0.05;（918±180）cpm vs （1109±117）cpm,P0.05。第8周，其表达开始减弱，组间无统计学差异(P0.05)，见表1。表1不同时间Col I mRNA的表达(RT-PCR法)时间激光组对照组P3天114±24118±110.051周760±119879±1210.052周1 120±3001 409±2970.054周918±1801 109±1770.058周313±115309±1190.05注：数据表示经凝胶分析仪校正后的光密度值(cpm)。

21、 2.损伤血管ICAM-1表达的检测结果：用免疫组织化学-LSAB法检测发现，血管损伤术后3天即可看到ICAM-1在血管内膜的微弱表达，但LPRLI组明显低于对照组(0.90±0.48 vs 1.79±0.91, P0.05)。第1周到第4周，LPRLI组的ICAM-1虽然逐渐增强，但仍然显著低于对照组(1.41±0.89vs 3.46±1.57, P0.01;2.60±0.91 vs 3.51±0.99, P0.05;2.31±1.00 vs 2.57±1.20, P0.05)。并可见到血管外膜明显表达ICAM-

22、1，LPRLI组位于外膜的ICAM-1的表达受到明显抑制。术后第8周，两组表达均显著减少，组间无统计学差异(P0.05)，见表2。表2不同时间ICAM-1免疫组织化学检测结果时间激光组对照组P3天0.90±0.481.79±0.910.051周1.41±0.893.46±1.570.012周2.60±0.913.51±0.990.054周2.31±1.002.57±1.200.058周1.41±0.801.40±1.100.05注：数据表示阳性细胞数积分。 3.LPRLI对VSMC凋亡的影响：在

23、光学显微镜下，对凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)进行记数，分别记数血管中膜和内膜细胞凋亡指数(apoptosis index)。每张切片记数200个以上的细胞，每个标本观察4张切片，取其平均值。细胞凋亡指数=凋亡细胞数/记数细胞总数×100%。镜下可见凋亡细胞的细胞核呈蓝紫色，均匀致密。损伤术后3天至1周凋亡指数两组间无显著性差异。术后第2周和第4周激光照射组凋亡指数显著增加(51±19 vs 29±11，P0.01;36±12 vs 26±8,P0.05)。第8周逐渐减少，组间无统计学意义。免疫组织化学-LSAB法检测p53、bcl-2/bax

24、基因表达，两组间无统计学意义，见表3。表3不同时间VSMC凋亡检测结果(TUNEL法)时间激光组对照组P3天8±28±10.051周15±713±50.052周51±1929±110.014周36±1226±80.058周27±524±80.05注：数据表示VSMC凋亡指数。 许多学者认为再狭窄的过程是一个血管损伤反应的新生内膜增生与血管重塑的过程。血管内超声研究表明，PTCA术后的再狭窄30%与新生内膜增生有关，而70%则与血管重塑有关。Currier2的研究发现如果代偿性扩张动脉和无代偿性扩

25、张动脉发生等量的内膜增生，内弹力板下内径代偿性增生10%，而最终的管腔内径将增加108%，显然血管内径或面积较小的变化可导致管腔内径较大的变化，这足以说明血管重塑对再狭窄的影响。引起血管重塑的机制并不清楚，一些研究认为血管剪切应力、细胞外基质、血管外膜的挛缩、VSMC的过度增殖是血管病理性重塑的主要原因。本研究从胶原代谢、血管损伤后的炎症反应、VSMC凋亡三方面探讨了LPRLI对血管损伤后的病理性重塑的影响。血管损伤便导致了胶原组织的破坏和非特异性炎症反应，胶原酶、基质金属蛋白酶(MMPs)活性增加，导致原有基质发生降解，细胞外纤维连接蛋白沉积，在损伤部位由成纤维细胞、VSMC等侵入病变区产生

26、了大量的基质成分，出现胶原纤维的交互连结，在这种原有基质成分降解和新的基质成分沉积的过程中便发生了血管重塑。细胞外基质的成分十分复杂，作用各不相同，胶原是其中最主要的成分之一，主要为型、型胶原，占胶原总量的80%90%，而型胶原又占其中的80%，本文选择型胶原用RT-PCR法观察了LPRLI对球囊损伤术后不同时间点胶原代谢的影响。我们发现从球囊损伤术后第1周开始，对照组ColmRNA的表达逐渐增强，而激光照射组的ColmRNA的表达逐渐减弱，说明一定剂量的LPRLI局部照射可以抑制Col的合成，此途径可能是其抑制病理性血管重塑的机制之一。LPRLI对胶原代谢的影响离体实验研究较多，且对照射剂量

27、的要求较高，不同的剂量将产生不同的甚至是相反的效果，因此，检测ColmRNA的表达量也是判定LPRLI疗效以及疗效与照射剂量之间关系的可靠指标之一。过去的观察指标是通过测定组织羟脯氨酸含量来间接估计胶原含量的变化，比较粗浅。在血管球囊成形术的损伤过程中，单核细胞在内皮细胞上的黏附和聚集是再狭窄早期的重要病理变化。黏附分子是单核细胞与内皮细胞黏附和相互作用的物质基础。正常血管内皮细胞不表达细胞间黏附分子或微量表达3，但是在动脉粥样硬化病灶可见ICAM-1表达明显增加。有关ICAM-1与再狭窄关系的研究报道较少，由于LPRLI可以抑制炎症反应，我们设想LPRLI预防再狭窄是否是通过抑制炎症反应来实

28、现的，因此，本文用免疫组织化学方法观察了血管损伤后不同时期ICAM-1的表达，发现LPRLI的确可以抑制其表达，最终结果可以抑制VSMC的增殖和迁移，减少胶原等基质的合成，从而减少病理性重塑，成为LPRLI预防再狭窄的又一机制。Kaule等4报道，附壁活化的白细胞产物可使猴动脉粥样硬化的血管收缩，附壁的白细胞可释放氧自由基，使EDRF/NO失活，白细胞膜上有ADP酶，可使ADP降解。由于ADP可刺激内皮细胞释放EDRF/NO，所以，ADP酶影响EDRF/NO的释放，因此，可以推测ICAM-1的过度表达会导致内皮功能的损害，LPRLI作用的结果应当可以通过抑制ICAM-1的表达来减少内源性EDR

29、F/NO的破坏，从而改善内皮功能。本研究还观察到单纯拉伤组除了位于内膜的内皮细胞和VSMC表达ICAM-1外，损伤的血管外膜也明显表达ICAM-1，且呈强阳性。Scott等5用BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)和-smooth muscle actin双标记法证实增殖的外膜细胞约(43.1±3.3)%可迁移到内膜，这些源于外膜的增殖细胞的性质是肌成纤维细胞。如果能够抑制这些细胞表达黏附分子，就可以减少炎症反应，减少新生外膜形成和外膜纤维化，因为，新生外膜不仅限制了血管的代偿性扩张，而且可造成损伤节段的挛缩，所以，LPRLI可能通过这一途径减少了血管损伤后期管径的

30、丧失。可见，LPRLI通过抑制炎症反应可以有效地减少损伤血管的病理性重塑。我们也观察了VSMC的凋亡情况，发现术后第24周LPRLI组凋亡指数较对照组明显增加(P0.05)，其余各实验终点组间无统计学差异。第8周两组凋亡指数均下降。p53、bcl-2/bax三个凋亡相关基因免疫组织化学检测组间无统计学意义。随着凋亡研究的不断深入，人们发现细胞凋亡是在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控使细胞程序性死亡的过程。LPRLI如能诱导VSMC凋亡对再狭窄的防治必将产生积极的影响，有可能成为LPRLI预防再狭窄的机制之一。凋亡的发生需要外源性信号诱导和内源性基因调控。TNF-、I

31、FN-、IL-1等细胞因子可诱导VSMC凋亡，而由细胞因子介导的VSMC凋亡分NO依赖性和非NO依赖性两种途径，炎性细胞诱导的VSMC凋亡可激活不同的信号途径，其中L-Arg/NOS途径可能是最初的触发途径，基因敲除技术和转基因技术均证明了这一点6,7，并且发现此途径是由p53基因调控，其跨膜信号转导并不依赖cGMP。根据本研究的结果，iNOS,p53均未参与此途径，可见LPRLI诱导VSMC凋亡的机制尚需进一步研究，是否非NO依赖性途径尚难以定论，因为，Koglin等6认为机体内环境的pH值、氧化还原反应等决定了NO的各种各样的生物学特性，也许炎症反应本身会改变NO的生物学特性。我们的理解是

32、由于LPRLI抑制了炎症反应过程，通过这一途径诱导VSMC凋亡的可能性不大，LPRLI是否直接作用于VSMC而诱发其凋亡尚需更深入的研究。作者单位：耿庆山（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）冯建章（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）陈纪言（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）周颖玲（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）李光（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）陈颜芳（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）林秋雄（广州市广东省心血管病研究所心内科510100）参考文献1，Pauschinger M, Doerner A, Remppis A, et al. Differential myocardial abundance of collagen ty