抗体交联脂质体的制备

1、抗体交联脂质体的制备第3l卷第9期2003年9月华南理工大学学报(自然科学版)JournalofSouthChinaUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition)Vo1.3lNO.9September2003文章编号:1000-565X(2003)09-0076-06抗体交联脂质体的制备林俏慧缪珑潘力罗立新郑穗平钟伟(华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640)摘要:采用超声波法制备包封色素脂质体,并使其能与乙肝抗体蛋白交联生成具有检测诊断功能的抗体交联脂质体.研究结果表明,用超声波法制备出来的脂质体包封色素效果较好,色素包封率为0.61%

2、;以戊二醛为交联剂将脂质体与乙肝抗体蛋白交联后所制备的脂质体,采用ELISA法进行检测,有活性.关键词:脂质体;支联;抗体;制备中图分类号:Q819文献标识码:A脂质体(Liposome)是由一层或多层类脂质双分子层形成的超微型球状载体制剂,可以用于药物运载和免疫检测J.近十多年来,脂质体在医药方面的研究和应用有很大的发展,一些药物的脂质体已用于多种给药途径和制剂中,如口服,静注,肌注,气管滴注和眼角膜等.而将单克隆抗体与脂质体连接起来制成抗体交联脂质体作为载体释放药物的新技术,既具有脂质体载药量大,在体内滞留时间长的特点,又具有单抗靶向专一性的优点,现已成为新型药物的定向传递系统,特别是能广

3、泛应用于恶性肿瘤的诊断和治疗中.本研究重点探讨抗体交联脂质体的制备及其相关影响因素.1仪器设备与材料(1)主要仪器设备.RE一52C旋转蒸发器,电热恒温水浴锅,TGL一16G冷冻离心机,NPS一15500超声波生化仪,SFZ752分光光度计,扫描电子显微镜,倒置显微镜,型酶标仪.(2)主要试剂材料.胆固醇,卵磷脂(大豆),三氯甲烷,曙红Y,TritonX一100,碳二亚胺,W:25%的戊二醛水溶液,乙肝免疫球蛋白,立可读HBsAgELISA试剂盒.收稿日期:2002.12.12作者简介:林俏慧(1981一)女,硕士生,主要从事酶工程研究.2实验方法2.1脂质体的制备方法采用超声波法研制脂质体.

4、将0.1mol卵磷脂和0.05mol胆固醇溶于12mL氯仿中,同时加入0.7mL曙红Y(150mmol/L),超声波处理23min直至形成均匀单相体系;在45下减压旋转蒸发45min以除去氯仿,再加入2mL缓冲液,振荡直至所有贴壁脂质从容器壁上脱落,最后进行1020S的超声波处理.2.2脂质体若干参数测定方法(1)脂质体大小,数目的测定.显微镜法:将脂质体混悬液稀释约100倍,取1滴滴入白细胞计数板内,计算视野见到的粒子总数.(2)脂质体包封率的测定.取15L已脱色素脂质体溶液与15LTritonX一100反应(必要时可以加热),加入磷酸缓冲液(PBS)稀释到3mL,在波长520nm处测得吸光

5、度.根据标准曲线得出色素浓度,并将其换算成原来的量,然后除以加入色素的量,即得包封率.2.3脂质体与抗体的交联采用戊二醛法进行脂质体与抗体的交联.取1.0mL脂质体溶液,加入103OLW=25%的戊二醛,于20放置10min,过量的戊二醛通过透析(2h)除去,加入1.010mg抗体,4温度下过夜.在16000r/min转速下,4离心15min,弃上清液,用PBS重复洗涤离心5次,弃上清液,将各管第9期林俏慧等:抗体交联脂质体的制备77沉淀脂质体重悬于0.5mLPBS中,置冰箱4储存备用.3结果与讨论3.1不同制备方法的比较本研究对逆相蒸发法和超声波法制备的脂质体进行了比较.实验结果表明,如图1

6、所示,逆相蒸发法制备的脂质体为大单室脂质体,数量不多,直径较大,不够均匀;超声波法所制备出来的脂质体多为小单室脂质体,数量多,直径小,很均匀.逆相蒸发法制备的大单室脂质体适合于包裹用于治疗的药物.而本研究目标主要是检测诊断试剂,所需的脂质体为小单室脂质体,故超声波法所制备的脂质体更符合本研究目的.(a)逆桕蒸发法(400)(b)超声波法(x400l图1不同方法对脂质体制备的影响Fig.1Influenceofpreparationmethodonliposomes3.2卵磷脂和胆固醇含量对脂质体的影响制备脂质体时主要采用卵磷脂(PC)和胆固醇(Cho1)这两种类脂.卵磷脂是脂质体的主要组成部分

7、,由一个亲水的头部和两条平行的疏水尾部组成,而胆固醇是另一类重要的类脂,是一种中性脂质.脂质膜是由磷脂与胆固醇分子相互间隔定向排列的双分子层所组成,胆固醇在膜中主要起改变纯磷脂层性质的作用.在其他因素都相同的条件下,不同的卵磷脂,胆固醇摩尔比对脂质体制备的影响如图2所示.由图可看出,只用卵磷脂(0.1p,mo1)作为膜材所制备的脂质体数量明显比其他几种情况的要少,而当n(卵磷脂):n(胆固醇)=2:1时,制备出来的脂质体数量又比其他两种情况的多一些.这说明胆固醇可以稳定双层膜,且稳定性较好,大小分布均匀.故本研究选择n(卵磷脂):n(胆固醇)=2:1.(a)H(卵磷脂):(胆固醇)=l:2(4

8、00)(b)H(卵磷脂):H(胆同醇)=I:I(x400(c),l(卵磷脂):H(胆固醇)=2:I(400)(d),l(卵磷脂):0.Iptool(x400)图2卵磷脂与胆固醇的含量对脂质体制备的影响Fig.2Influenceofcontentsoflecithinandcholesterolonthepreparationofliposomes3.3旋转蒸发温度对脂质体的影响在n(卵磷脂):n(胆固醇)=2:1的最佳条件下,探讨旋转蒸发温度为27,36,45下对脂质体制备的影响.研究结果如图3所示,在旋转温度为27,36时所制备的脂质体稳定性不好,经超声波处理后数量少;而在旋转温度为45时

9、制备的脂质体数量多,大小分布均匀.本研究选择45为旋转蒸发温度.78华南理工大学学报(自然科学版)第31卷图3旋转蒸发温度对脂质体制备的影响Fig.3Influenceoftherotaryevaporatortemperatureonthepreparationofliposomes3.4有机溶剂的种类对脂质体的影响采用氯仿和乙醚做溶剂进行脂质体的制备研究.研究结果表明,用氯仿或者乙醚作为溶剂对脂质体的制备均没有很大的影响,氯仿和乙醚对卵磷脂和胆固醇都有较好的溶解性,并均可通过旋转蒸发被除去,对脂质体形态基本没有影响.如图4所示.(a)氯仿(x400)(b)乙醚(400)图4有机溶剂的种类对

10、脂质体制备的影响Fig.4Influenceofthedifferentorganicsolventonthepreparationofliposomes3.5脂质有机相与色素溶液量比例对脂质体包封效果的影响以包裹色素作为指示剂,制备诊断用的抗体交联脂质体.色素曙红Y为红色粉末,溶于水,呈玫瑰色并带有荧光,难溶于醇.本研究探讨了不同脂质有机相与色素水相的比例对脂质体包封率的影响,如表1所示.表1不同色素添加量的包封率Table1Ratioofencapsulad?dyeindifferentamountsofdye包封率/%y(色素溶液量)/y(色素溶液量)一12:0.3o.55I2:I.I5

11、.0912:0.70.6ll2:1.53.64从表1可看出,添加的色素量不同,制备出来的脂质体包封率也不同.实验结果表明,在12mL脂质有机相中加入1.1mL色素时制备的脂质体包封效果最好,包封率最高.但由于我们要制备的是检测用脂质体,需要的脂质体体积要小且均一,所以我们采用超声波法,即在制备脂质体的最后一个步骤用超声波再破碎一次脂质体,使脂质体体积更小,更均一.因此制备出来的最好脂质体的包封率也不高.3.6超声波处理对脂质体的影响3.6.1超声波处理方式对脂质体的影响超声波处理有探头型和水浴型两种方法.探头型超声波器可以获得相当强的能量,能在短时间内使大脂质体变小.水浴型超声波方法比探头型超

12、声温和,但所需时间长,而且因为辐射的区域大,不可能达到超声脂质体粒径的最小极限.由于本研究中所制备脂质体的量不多,而探头型超声波处理能使脂质有机相和色素形成更均匀的单相体系,且脂质体更小,更均一,更符合本研究的要求,如图5所示.本研究采用探头型超声破碎方法.第9期林俏慧等:抗体交联脂质体的制备Ia)探头型超声破碎(x4OO)(b)水浴型超声破碎(x400)图5不同超声波处理方式对脂质体制备的影响Fig.5Influenceofthedifferentmethodtreatedbyultraso-nicwaveonthepreparationofliposomes3.6.2超声波处理时间对脂质体

13、制备的影响如图6所示,随着超声波处理时间的增长(由14min),制备出来的脂质体直径变小;但当超声波处理时间过长(4min)时,会导致脂质体的数量减少.因此选择23min的超声波处理时间,这样制备出来的脂质体不仅直径小,数量多,而且分布均匀,更适合本研究的需要.Ia)超声波处理lrainIx400)b)趣声波处理2rainIx400)(c)超声波处理3min(x400)(d)超声波处理4min(x4oo)图6超声波处理时间对脂质体制备的影响Fig.6Influenceofthetimeofultrasonicwavetreatmentonthepreparationofliposomes3.7

14、脂质体的形态观察与计数(1)形态观察.我们将采用最优化条件制备出来的脂质体(即是将0.1mol的卵磷脂和0.05mol的胆固醇溶于12mL氯仿中,加入0.7mL色素溶液,采用超声波处理2rain以后,在45的温度下旋转蒸发45rain,再加入2mL缓冲液振荡,最后进行lOs超声波处理制备出来的脂质体)置于电镜下进行观察,发现脂质体呈均匀圆形,效果比较好.如图7所示.(2)脂质体计数.我们采用血球计数器对脂质体个数进行计数,数出在最优化条件下所制备的脂质体浓度为6.4lO个/mL.图7电镜下脂质体形态Fig.7Shapeofliposomeobservedbyelectronmicroscope

15、华南理工大学学报(自然科学版)第3l卷3.8未包封色素的分离去除未包封色素的方法有离心法,透析法和微型凝胶柱离心层析法.离心法是脱色素最直接最方便的方法,所需时间不长,效果比较好.透析脱色法可以使脂质体的损失减到最少,但这种方法需要的时间很长(过夜),而且脱色素效果也不是很好.微型凝胶柱离心层析脱色素虽然效果比较好,但脱色工序非常繁琐,损失也相当大.本研究使用离心法去除未包封色素.3.9脂质体与抗体的交联3.9.1交联方法的比较脂质体与抗体的结合方法有吸附法,渗入法,交联法和抗体衍生法.吸附法效率很低;渗入法不适合水溶性蛋白,而且效率也很低;抗体衍生法效果好,但用到的衍生试剂太贵,成本太高;交

16、联法的效果仅次于抗体衍生法,价格相对比较低,成本低.本研究采用交联法.交联法中用到的交联剂有碳二亚胺和戊二醛.本研究探讨碳二亚胺(EDCI)和戊二醛这两种交联剂对交联的影响.由于碳二亚胺制备的抗体交联脂质体在5次离心后用ELISA法检测不出活性,而用戊二醛制备的抗体交联脂质体经过同样处理后可以检测出活性;因此,本研究在脂质体与抗体的交联时采用戊二醛作为交联剂.39.2戊二醛用量对交联的影响在其他条件都相同的情况下,探讨戊二醛用量对脂质体与抗体交联的影响如表2所示.表2戊二醛用量对脂质体与抗体交联的影响Table2Influenceofcontentsofglutaraldehydeoncros

17、s-linkoffiposomeandantibody由表2可知,随着戊二醛用量的增加,抗体交联脂质体的蛋白质量浓度也跟着增加,也就是说交联脂质体的抗体量随着增加;但当戊二醛用量为0.69%(质量分数,下同)时,所制备出来的抗体交联脂质体活性最大,故本研究采用0.69%的戊二醛进行脂质体与抗体的交联.3.9.3蛋白质抗体质量浓度对交联的影响在其他条件都相同的条件下,探讨不同抗体质量浓度对交联的影响如表3所示.表3抗体质量浓度对抗体交联脂质体的影响Table3Influenceofmassconcentrationofantibodyonanti?bodycross-finkedliposome

18、由表3可知,随着抗体质量浓度的增加,抗体交联脂质体的蛋白质量浓度反而降低.这说明对1mL脂质体溶液来说,有2.83mg/mL的抗体已经足够;但在抗体为4.63mg/mL下交联的抗体交联脂质体活性最强,故本研究采用4.63rag/mL的抗体与脂质体进行交联.4结论通过实验研究,确定了制备交联抗体脂质体的最佳反应条件:,l(卵磷脂):,l(胆固醇)=2:l;最佳旋转蒸发温度为45oC;在12mL脂质有机相中加入1.1mL曙红Y色素时制备的脂质体包封效果最好,色素包封率为0.61%;探头式超声波处理23min制备出来的脂质体更符合本研究要求;最佳的去除未包封色素的方法是离心法,16000r/min的

19、转速,离心5次(15Illin/次)的分离效果最好;在最优化条件下制备的脂质体浓度为6.4xlO个/mL,在电镜下观察呈均匀圆形,效果较好;用戊二醛作为交联剂交联脂质体与乙肝抗体蛋白,最佳的戊二醛用量和抗体蛋白质量浓度分别为0.69%和4.63mg/mL;用ELISA法检测最优条件下制备的交联抗体的脂质体,有活性.参考文献:1SungsuPark,RichardA.Immunoliposomesandwichas-sayforthedetectionofEscherichiacoliO157:H7J.AnalBiochemistry,2000,280:15l一158.2GarberBP,Lig

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22、Univ.ofTech.,Guangzhou510640,China)Abstract:Thedye?encapsulatingliposomewhichispreparedbyultrasonicwaveCallbeusedinimmunodiagnos?ticappficationaftercross?finkedwithantiHbsAgantibodies.Theresultsshowthatthedyeencapsulatinglipo-somespreparedbyultrasonicwavemethodarecircularandstable.Theratioofencapsul

23、ated?dyeis0.61%.Andtheactivityoftheanti?HbsAgantibodycross-linkedfiposomesinwhichglutaraldehydewasascrosslinkerhasbeendetectedbyELISAmethlod.Keywords:liposome;crosslink;antibody;preparation(上接第52页)参考文献:1234熊辉,沈尧天,姚仰新.一类双调和Dirichlet问题的非平凡解J.华南理工大学学报(自然科学版),2003,3l(4):7881.AlvesCO,JoaoMarcosdo0,Miyaga

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