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文档简介

1、2003年第6期总第100期山东教育学院学报凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究王玢1,袁方曜2(1.山东教育学院生物系,山东济南250013;2.山东省农科院,山东济南250100)摘要:海洋细菌MB1产生的纤维素酶粗酶液,经盐析、透析,分别上葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-100,SephadexG-75和SephadexG-50进行分离纯化,以SephadexG-75分离效果最好,得到一个电泳纯的外切酶组分,该酶的比活力由6.94Umg-1提高到200.9Umg-1,提高了28.9倍,总收率8.6%。关键词:纤维素酶;外切酶;凝胶过滤;柱层析;分离纯化中图分类号:Q814.1文献标识码

2、:A文章编号:10082816(2003)06008803随着各种蛋白质纯化技术的出现,纤维素酶的分离纯化研究也取得了很大进展,药、饲料和纺织等领域,各,才能了解其组成、,质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和DNA体外定点诱变等提供依据。通常,纤维素酶的分离纯化多采用离子交换层析。由于酶蛋白分子表面电荷的不均一性1,对离子交换剂表现了不同的亲和力,且离子交换剂与酶蛋白分子之间的亲和力不仅取决于酶分子表面携带电荷数目多寡,而且与其分子内电荷排布有关;而在离子交换层析中,只有分布在蛋白质分子亲水表面的电荷才发挥作用,而存在于分子疏水核

3、心中的电荷在离子交换中不起作用。因而,一个简单的洗脱条件很难将多种酶蛋白分离开来,往往需要复杂的洗脱条件才能得到纯酶。凝胶过滤层析是根据样品中各种物质分子量的不同,通过多孔凝胶床达到分离的目的2。这种方法条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜。取MB1菌种发酵液3于4,8000rpm,离心15分钟,收。1.2:10,000NMWL透析袋,10,000NMWL聚。素酶活为102g/mL,蛋白质含量为14.7mg/ml。-SPGE采用垂直板式不连续系统电泳,分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,用0.25%(W/V)考马斯亮收稿日期:20030711),女,山东济南市人,讲师;

4、袁方曜(1962),男,山东济南市人,副研究员。作者简介:王玢(1962取上述样品各4mL,分别上SephadexG-100,SephadexG-75和SephadexG-50凝胶层析柱,结果分别见图1、图2、图3。活和微晶纤维素酶活得很高,没有得到纯酶。(2)图2显示,样品经SephadexG-75柱层析分离后,得到三个主要的峰。分别称为峰、峰和峰。分别测定各峰液中的外切酶活和内切酶活,结果表明,峰只具有较高的外切酶活。收集峰酶液,浓缩后进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示,仅为一条带,说明该组分已被提纯。(3)图3层析图谱显示,样品SephadexG-50柱层析后,出现两个主要的峰,经测

5、定,峰内切酶活和外切酶活均较高;峰主要是外切酶活,亦有少量内切酶活,没有分纯。以上实验结果表明,利用不同交联度的葡聚糖凝胶SephadexG-100、SephadexG-75、SephadexG-50进行纤维素酶分离纯化,以SephadexG-75分纯效果最好;经SephadexG-75柱层析后,得到一个具有外切酶活的纯组分。纯化结果见表1。表1G-U)倍数(fold)128.9酶活收率ss1008.6图1SephadexG-751020008840Fig.1ofSephadexG-1003讨论(1)利用SephadexG-100、SephadexG-75和SephadexG-50三种葡聚糖凝

6、胶对纤维素酶进行分离纯化,以SephadexG-75分离效果最佳,得到一个电泳纯的外切酶组分,比活图2SephadexG-75凝胶层析图谱Fig.2GelfiltrationchromatogramofSephadexG-75力提高了28.9倍。(2)凝胶过滤层析也称为大小排阻层析,与其他类型的层析技术不同,凝胶柱系由均匀装填的多孔凝胶微粒组成,蛋白质分子据通过微孔迁移能力的不同而被分离。在理想的理论情况下,凝胶柱系不涉及蛋白质与填料之间的吸附的排斥作用,故蛋白质的迁移能力仅取决于其分子的大小,分子量大的物质先被洗脱出层析柱,而分子量小的物质后被洗脱下来,从而达到分离的目的;选用适宜的凝胶,并

7、保证其均一性,是纯化成功与否的关键。(3)该纤维素酶纯化的回收率较低,只有8%,可能与该适冷酶热稳定性较差有关,虽然操作在4下进行,但酶活丧失仍较高。参考文献:1何忠效等.现代生物技术概论M.北京:北京师范大学出版图3SephadexG-50凝胶层析图谱社,1999,168.ization:ALabroratoryCourseManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996.3王玢,汪天虹等.产低温纤维素酶海洋适冷菌的筛选和研究J.海洋科学,2003,27(5):42-45.4HorikoshiK,NakaoM,KuronoY,etal.Cellulase

8、ofanalkalophilicFig.3GelfiltrationchromatogramofSephadexG-50(1)由图1层析图谱可以看出,样品经过SephadexG-100柱析分离后只得到一个大而缓的峰,峰液中的CMC酶王玢等:凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究2003年第6期90779.5李建武等.生物化学实验原理和方法M.北京:北京大学出版社,1994,168-170.SeparationandPurificationofCellulasebyColumnChromatographyoftheGelFiltrationWangBin1,YuanFangyao2(1.Shando

9、ngeducationalcollege250013;2.ShandongAcademyofAgriculturalSciences250100)Abstract:ThecrudecellulaseextractionfromamarinebacteriumMB1wasseparatedandpurifiedbytheammoniumsulfateprecipitation,dialysisandcolumnchromatographyofSephadexG-100、SephadexG-75andSephadexG-50.TheeffectoftheSephadexG-75wasthebest

10、andonecellobiohydrolase(CBH)waspurifiedtoelectrophoretichomogeneitybySephadexG-75columnThespecificactivityoftheenzymewasraisedfrom6.94Umg-1to200.9Umg-1,whichwas28.timesthatofwithayieldof8.9%.Keywords:cellulase;cellobiohydrolase;gelfiltration;column(上接87ApplicationofCellVariantsinPlantYuHuimin,ShiZhu

11、(DepartmentofBiology,ShandongEducationCollege,Jinan250013,China)Abstract:Theexpetedadversity-resistanceofplantcellcanbeselectedbythetissuecultureinviroundercertainstressfactors.Thispa2permainlyanalysedandreviewedtheselectionandapplicationofallkindsofdirectivelyselectedcellvariantsreportedinrecentyears.Par2ticularly,thefocusofthispaperwasputonthecellvariantswhic

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