二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用

1、第33卷第4期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.33 No.4 2007年8月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Aug2007 文章编号：1007-1032(2007)04-0496-04二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用谢文刚a，b(湖南农业大学a.理学院；b.东方科技学院，湖南 长沙 410128)摘 要：以荧光染料(联吡啶钌配合物)为核，二氧化硅为外壳制备了荧光纳米颗粒电镜检测结果显示， 合成的二氧化硅纳米颗粒粒径为(203) nm，分布均匀，形态规则对荧光纳米颗粒进行生物修饰得到荧光探针，

2、以DNA碱基配对原则为基础建立检测DNA的方法，利用激光扫描共聚焦显微镜研究玻片上的荧光信号和荧光强度结果表明，该方法不仅可定量检测到4.4108 mol/L的目标DNA3，而且可定性检测目标DNA3、单碱基错配DNA4及随机序列DNA5，为发展DNA检测技术提供了新的思路关键词：荧光纳米颗粒；核酸探针；DNA检测 中图分类号： O644文献标识码：ASynthesis and application of silicon dioxide biological fluorescent nanoparticlesXIE Wen-ganga，b(a. College of Sciences；b.

3、College of Orient Science Technology，HNAU，Changsha 410128，China)Abstract：The Fluorescence-doped silicon nanoparticles were synthesized in a microemulsion system of triton-100 /cyclohexane/ ammonia hydroxide and characterized by techniques of electron microscopy.Nanoparticles were modified with bioti

4、n-DNA1 in order to obtain fluorescence probeA method to monitor target DNA3 was set up on the basis of princile of DNA base complementary. Fluorescence signals were monitored by laser-scanning confocal microscopy for the detection of surface-bound fluorescent nanoparticlesThe results showed that tar

5、get DNA3 of 4.4108 mol/L can be monitored by this method，which can also identify target DNA3 and single base unmatched DNA4 and random DNA5 effectivelyThe method potentially serves as a useful platform in a number of biomedical applications where accurate and sensitive gene analysis is criticalKey w

6、ords：biological fluorescent nanoparticles；nucleic acid probe；DNA detect生命体内痕量活性物质的分析与检测对获取生命过程中的化学与生物信息、了解生物分子及其结构与功能的关系、阐释生命活动的机理以及疾病生物荧光纳米颗粒的成的诊断都具有重要意义1-3功研制为在复杂的环境中进行最佳的单分子研究提供了条件生物荧光纳米颗粒的粒径为1100 nm，具有巨大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性，使其与生物体有特殊的相互作用，并得到了广泛应用，如可实现对SmIgG+ B淋巴细胞、HepG肝癌细胞、WA系统性红斑狼疮疾病细胞和白血病收稿日期：2

7、007-01-10基金项目：湖南农业大学基础科学基金(62020206002)作者简介：谢文刚(1966-)，男，湖南吉首人，硕士，副教授，主要从事生物无机化学方面的研究.特征细胞等的识别4-5但生物荧光纳米颗粒在DNA检测方面的应用鲜有报道6为此，笔者利用微乳液法制备二氧化硅纳米颗粒，并对其进行生物修饰，以DNA-DNA的特异识别与结合作用为基础，以三明治结构为模型(勿需对检测对象进行标记) ，研究了生物荧光纳米颗粒在DNA检测中的应用，旨在为发展新型DNA检测技术提供依据1 材料与方法1.1 试验材料联吡啶钌配合物(Ru(II)(bpy)32+.6H2O，Fluka公司)，链霉亲和素(美国

8、Sigma公司)，DNA片段(上海生工生物试剂有限公司合成)所用DNA的序列如下：第33卷第4期 谢文刚 二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用 497DNA1：5-TTATAACTATTCCTA(A10)-biotin-3 (修饰探针)；DNA2：5-biotin-A10CTCCCTAATAACAAT-3 (固定探针)；DNA3：5-TAGGAATAGTTATAAATTGTTATT AGGGAG-3(检测目标)；DNA4：5-TAGGAATAGTTTTAAATTGTTATT AGGGAG-3 (单碱基错配)；DNA5 5GTAATGAGTGAAAGGTATTTGTAG TTGAAT-3 (随机

9、序列)溴化氰根据文献7合成，其他试剂均为国产分析纯试验用水均为二次蒸馏水主要仪器：日立F-2500型荧光分光光度计(激发波长290 nm，发射波长340 nm)；19HW-1型恒温磁力搅拌器；激光共聚焦显微镜FV500+IX70(日本)；高速冷冻离心机CR22G(日本) 1.2 方 法环己烷、正己醇、表面活性剂triton-100按411的比例混合，加入二次蒸馏水，搅拌至清，分别加入联吡啶钌配合物溶液、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水，持续搅拌24 h，反应结束后用丙酮、二次蒸馏水洗涤，12 000 r/min离心分离，制得荧光纳米颗粒，保存备用检测原理如图1所示以荧光纳米颗粒标记寡核苷酸片段DN

10、A1为检测探针，与目标DNA3和固定探针DNA2进行夹心式杂交，形成三明治结构复合8体，用链酶亲和素化的玻片对复合体进行捕获，洗涤，用激光共聚焦显微镜检测玻片上的荧光纳米颗粒的荧光信号，并用软件(Fluoview tiempo time course software ver5)分析荧光强度，从而实现对目标DNA3的检测把荧光纳米颗粒加入到碳酸钠溶液中，超声分散，加入溴化氰/乙腈溶液，室温下搅拌，再分别用冰水和PBS(磷酸缓冲液，pH=7.4)溶液洗涤，颗粒置于PBS溶液中保存向链霉亲和素溶液中加入已活化的荧光纳米颗粒，在4 下搅拌24 h，用1 mol/L甘氨酸溶液封闭，离心、洗涤向颗粒中加

11、入生物素化的寡聚核苷酸(biotin-DNA1)(图1-a，b)，常温下反应2 h，用PBS溶液洗去多余的生物素化DNA1溶液，荧光颗粒于4 保存备用杂交后的溶液滴加在链霉亲和素化的玻片上(图1-e)，每一个浓度的DNA溶液点3个样，玻片置于55 水浴锅中培育，再分别用2SSC(含 0.2%SDS)，70%甲酰胺(含30 mmol/L NaCl)，1SSC (含0.1%SDS)，0.05SSC洗涤，晾干图1 DNA的检测原理Fig.1 Schematic representation of the analytical protocol2 结果与分析2.1 荧光纳米颗粒的表征由图2可知，荧光纳

12、米颗粒的粒径为(203) nm，表面光滑圆润，且纳米粒子分布均匀498 湖南农业大学学报(自然科学版) 2007年8月Magnification:100 000；d =(203) nm与玻片上的链霉亲和素特异性地结合，从而把杂交复合体固定在玻片上(经得起洗涤)，使玻片交联荧光纳米颗粒，产生荧光信号若体系不存在检测目标DNA3，通过洗涤，荧光颗粒洗去，玻片无荧光若体系中检测目标DNA3浓度较大，则有较多的荧光纳米颗粒被固定在玻片上，产生较强的荧光信号(见图5)图2 荧光纳米颗粒的透射电子显微镜图Fig.2 TEM micrograph of monodisperse fluorescent na

13、noparticle经溴化氰活化的荧光纳米颗粒，表面带氰酸酯活性基团，与链霉亲和素蛋白中的氨基发生反应，生成异脲衍生物9，将链霉亲和素交联在颗粒表面从图3可明显看出，荧光纳米颗粒与链霉亲和素反应后，导致链霉亲和素溶液荧光强度(340 nm)显著下降，因此可确定链霉亲和素已连接到荧光纳米颗粒的表面将已修饰链霉亲和素的荧光纳米颗粒加入到生物素化的DNA1溶液中，由于链霉亲和素-生物素的特异作用，使DNA1连接到纳米颗粒上，导致溶液中DNA1的紫外吸收下降(260 nm)，如图4所示为此，制得荧光探针图4 DNA1紫外光谱Fig.4UV spectra of DNA1图5 不同浓度目标DNA3的荧光

14、强度Fig.5 Fluorescence intensity of different concentrations of the target DNA3对相同浓度的目标DNA3、单碱基错配的DNA4及随机序列DNA5和PBS对照所检测到的荧光强度进行归一化处理得到图6从图6可知，完全匹配的DNA3所检测到的荧光信号比单碱基错配DNA3能与DNA1和DNA2完全匹配，经过洗涤，荧光纳米颗粒能固定在玻片上，从而产生很强的荧光信号而单碱基错配的DNA4及随机序列DNA5由于不能与DNA1和DNA2完全匹配，形成的三明治结构的杂交复合体在热力学上是不稳定的，杂交速度也不如前者，在洗涤时，荧光纳米颗粒

15、被洗去，图3 链酶亲和素荧光光谱 的DNA4及随机序列DNA5的信号要高，这是因为Fig.3Fluorescence spectra of streptavidinDNA3的检测DNA的杂交以碱基互补配对为基础，目标DNA3能与DNA1和DNA2进行夹心式杂交，形成三明治结构复合体把杂交复合体转移到链霉亲和素化的玻片上，则固定探针DNA2上的生物素可以第33卷第4期 谢文刚 二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用 499在玻片上产生较弱的荧光信号因此，该方法能将完全互补的单链DNA与非完全互补的单链DNA鉴别开来，从而实现对DNA的定性检测参考文献：1 李朝辉，王柯敏，谭蔚泓硅壳包被的核壳型量子

16、点荧光纳米颗粒的制备及其在细胞识别中的应用J科学通报，2005，50(13)：1318-13222 Zhong Xiao-bo，Reynolds Robert，Judith R K，et alSingle-nucleotide polymorphism genotyping on optical thin-film biosensor chipsJPNAS，2003，100(20)：11559-115643 黄永华，龙 姝，蔡红革N-萘酚醛-D-氨基葡萄糖席夫碱甘氨酸金属配合物与DNA作用的谱学研究J. 湖南农业大学学报：自然科学版，2002，28(2)：156-158. 4 李 军，王柯敏，

17、何晓晓纳米尺度和单分子水平上的化学生物学研究J大学化学，2004，19(1)：11-15 5 朱诗国，唐 珂，向娟娟生物荧光氧化硅纳米颗粒的研制与应用J物理化学学报，2003，19(4)：311-314 6 Csaki A，Straube W，Fritzsche W，et alDNA monolayeron gold substrates characterized by nanoparticle labeling and scanning force microscopyJNucleic Acids Research，2001，29(16)：1-57 日本化学会无机化合物合成手册K曹惠民，译第一卷北京：化学工业出版社，1998：205-206 8 何晓晓，王柯敏，谭蔚泓基于生物荧光纳米颗粒的新型荧光标记方法及其在细胞识别中的应用J科学通报，2001，46(16)：1353-13569 蒋中华，张津辉生物分子固定化技术及应用M北京：化学工业出版社，1998：26-28图6 归一化处理后DNA样品的荧光强度Fig.6 No