微生物限度检查方法的验证

1、微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理包括:1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证准确性（回收率）2.控制菌检查法的验证专属性3.实例一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证1.验证的目的：确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。2.验证的步骤：根据样品特性，制定检验方法和检验条件。保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 按制定的方法进行试验。根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结

2、果符合设立的验证标准。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。3. 验证用菌株：细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。 霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。第 1 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:50100cfu。4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法

3、、中和法、离心沉淀法、联合方法。5.样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。7.菌液制备(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，3537培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至1010，使菌数约为50100cfu/ml。(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，2328培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至1010，使菌数约为50100c

4、fu/ml。(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 2328培养57天，加35ml0.9无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至1010，使菌数约为50100cfu/ml。8.供试品的处理：固体：10g 供试品+稀释剂至100ml液体：10ml供试品+稀释剂至100ml抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。第 2 页 共 21 页 -4-6-5-7-5-7微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 菌液组 供试品对照组 试验组 稀释剂对照组每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。8.1菌液组：

5、测定所加的试验菌数。平皿法：取试验用的1ml菌液（约50100cfu），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。8.2供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（和试验组采用同法）8.3试验组：平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按平皿

6、法测定其菌落数。薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张膜。离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心35min，取上清液，再以3000 r/min第 3 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理离心1030min，取下面1ml液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。8.4稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对

7、照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 9.结果判断指标试验组的菌回收率（70%） 稀释剂对照组的菌回收率（70%） 10. 回收率计算：表1 试验组回收率测定结果阳性菌 实验次数1大肠 埃希菌2 3 1枯草芽孢杆菌2 3金黄色葡萄球菌1 2 3 1白色 念珠菌2 3菌液组 菌落数试验组 菌落数供试品对照组菌落数回收率第 4 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理1黑曲 霉菌 注： 2 3（试验组平均菌落数供试品对照组

8、平均菌落数）菌液组平均菌落数第 5 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 每一验证菌株均应进行上述试验。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。11.回收率测定举例11.1供试液不用特殊制备方法菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：B）试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计

9、算供试液平均菌数：A）回收率=(AB)C100%菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：最低稀释级供试液1ml分别注5个平皿，0.2ml /平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液平均菌数：B）试验组：最低稀释级供试液0.2ml+1ml菌液/平皿，注5个平皿，平行2份（计算平均菌数：A)回收率=(AB)C100%培养基稀释法可以是1ml供试液注2个、5个或更多个平皿。但是更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。第 6 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 11.2供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等)菌液组：1ml菌液

10、 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml /平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：B）试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：A）稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml菌液，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：D）试验组回收率=(AB)C100%稀释剂对照组回收率=DC100%菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：最低稀释级供试液1ml分别注5个平皿，0.2ml /平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液平均菌数：B）试验组：最低稀释级供试

11、液0.2ml+ +加中和剂或乳化剂1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)试验组回收率=(AB)C100%稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml菌液，平行2个平皿（稀释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D)稀释剂对照组回收率=DC100%菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液10ml +离心，500rpm离心取上清，第 7 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 加稀释剂至10ml ，取1ml 注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：B)或3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml ，取

12、1ml 注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：B)试验组：最低稀释级供试液10ml+离心，500rpm离心取上清，加稀释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)或3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)试验组回收率=(AB)C100%稀释剂对照组：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂10ml，3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：D)（稀释剂对照组与试验组同法操作）稀释剂对照组回收率=DC100%菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平

13、均菌数：C) 供试品对照组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：B)试验组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，+1ml菌液，过滤，至少1张膜（菌落计数：A)稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：D) 过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上，菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。试验组回收率=(AB)C100%稀释剂对照组回收率=DC100%第 8 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 11.3计数方法的确定细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。细菌以各试

14、验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。11.4计数方法的验证结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则按此供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。二、控制菌检查法的验证1.试验菌株：按规定检查的控制菌选

15、择相应验证的菌株。1.1阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠埃希菌 。1.2菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。1.3加菌量:10100cfu验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。第 9 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理2控制菌检查验证用菌株：大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌 。2.1口服制剂大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查大肠菌群按大肠菌群项下检查沙门菌按沙门菌项下检查2.2外用制剂铜绿假单胞菌按铜绿假单胞菌项下检查金黄色葡萄球菌按金黄色葡萄球菌项

16、下检查生孢梭菌按生孢梭菌项下检查3.验证方法选择：常规法、稀释法、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。4.供试品量：1g或1ml，沙门菌检查为10g。5.培养基：营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、MUG培养基、胆盐乳糖第 10 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 发酵管、四硫磺酸盐增菌液、胆盐硫乳琼脂平板、麦康凯琼脂平板、溴代十六烷三甲胺平板、甘露醇氯化钠平板、0.1%疱肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板。6.菌液制备接种大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，3537培养1824小时，取此培养液1ml加

17、0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至1010，使菌数约为10100cfu/ml。6.1常规法：第 11 页 共 21 页 -5-7微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理于200ml）营养肉汤培养基中，混匀，阳性菌对照加入沙门菌10100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu ，3537培养1824小时，取此培养物1ml接种于10ml四硫磺酸盐增菌液，培养1824小时后划线于胆盐硫乳琼脂平板、麦康凯琼脂平板观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对沙门菌无抑菌作用且专属性好。若阳性菌未检出则表明该样品对沙门菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。表明该样品

18、对铜绿假单胞菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。第 12 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌无抑菌作用且专属性好。若阳性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。7.结果判断：阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验菌，表明该法专属性强，可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，表明该供试品有抑菌作用，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。大肠埃希菌检查流程图供试品供试液不少于100ml的胆盐乳糖增菌

19、液35371824h取0.2ml5mlMUG培养基中35375、24h366nm紫外光下观察加靛基质试剂MUG阳性，靛基质阳性MUG阴性，靛基质阳性MUG阴性，靛基质阴性MUG阳性，靛基质阴性取胆盐乳糖培养液划线报告曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板3611824h阳性阴性镜检、适宜的生化试验报告报告8.培养基稀释法：供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大为1：300、1：第 13 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 500或1：1000。由于盛放培养基容器体积有限，一般放大到500ml或1000ml。本法适用于抑菌作用不强的中西药制剂，操作简便易行，应用范围

20、广泛。9.薄膜过滤法：采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。10.离心沉淀法：取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心35min，取上清液，再以3000 r/min离心1030min，取下面1ml液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养。本法适用于中度抑菌作用的中西药制剂。11.中和法：在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌性成分的作用。中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。常见的中和剂有:(1

21、)磺胺类药物:加入适当的对氨基苯甲酸(2)含重金属的药物:在培养基中加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸(3)洗必泰制剂:加入聚山梨酸80(3%)或卵磷脂(3%)(4)卤素:加入硫代硫酸钠(0.1%)三、药品微生物限度检查法验证示例例1.xxxxx胶囊微生物限度检查法验证试验第 14 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理1.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。来自xxxxx。第 15 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理常规法

22、、培养基稀释法在xxxxx胶囊微生物限度检查法的验证结果见表1、表2。表1 xxxxx胶囊微生物限度检查方法验证 （常规法）人工染菌回收率(%)试供试验品浓次度 数金黄色葡萄大肠埃希菌球菌稀释稀释试验试验剂对剂对组 组照组 照组枯草杆菌 稀释试验剂对组黑曲霉稀释剂对照组稀释试验剂对组照组1 54.6 96.3 91.82 61.2 94.4 89.83 60.3 93.3 90.1表2 培养基稀释法（1ml加2个平皿）xxxxx胶囊微生物限度检查验证试验供试品次数 浓度 1 21:10 1:10人工染菌回收率(%)金葡菌试验组 稀释剂对照组80.7 91.496.5 95.8枯草杆菌试验组 稀

23、释剂对照组 97.2 96.496.3 97.5第 16 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 3 1:10 85.3 92.8 97.5 94.9从表1结果可以看出:采用常规方法检验xxxxx胶囊供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。表2中的结果证明，采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌作用。回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法（0.5ml/皿）可用于xxxxx胶囊的微生物限度检查。根据验证试验结果，确定xxxxx胶囊微生物限度检查法为细菌数测定可采用培养基

24、稀释法（0.5ml/皿）测定，霉菌数可采用常规法测定。1.2控制菌检查方法的验证a.大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44 102b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003 c.乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) CMCC(B) 50 094 d.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10 104 e.生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B)64 941来自xxxxxx。接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌

25、、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物到硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu（菌落形成单位）的菌第 17 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 悬液。取样品10g，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。(1) 试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤

26、膜接入增菌培养基中(2) 阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。试验组检出控制菌，阴性对照组未检出。根据验证试验结果，确定xxxxxx胶囊的控制菌检查可采用常规法测定。例2.银翘解毒片常规法试验次供试品浓度 回收率(%) 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉第 18 页 共 21 页微生物限度检查方法的验证 ygfyzy整理 数稀释剂对照组 96.3 94.4 93.3稀

27、释试验剂对组15 9.7稀释剂对照组96.990 93.5稀释剂对照组 94.9 96.2 97.1试验组 试验组 91.8 89.8 90.1试验组 91.5 92.3 91.5试验组 92.5 91.4 90.81 1:10 92.5 2 1:10 90.1 3 1:10 91.1稀释法、低速离心+稀释法 (枯草杆菌)回收率(%)试验次数 1 2 3供试品浓度稀释法(5个平皿) 试验组 32.3 40.3 36.7稀释剂对照组 96.5 95.8 92.8稀释法(10个平皿) 试验组 48.1 43.0 52.5稀释剂对照组 96.3 97.5 94.9低速离心+稀释法稀释试验组 剂对照组

28、 72.2 78.5 75.097.2 96.4 97.51:10 1:10 1:10结论银翘解毒片的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法 细菌计数：低速离心+稀释法 真菌计数：常规例3.霍香正气水常规法试供试验品稀次释级 数 1 1:10 2 1:10 3 1:10回收率(%)大肠埃希菌2.5 2.6 1.6金黄色葡萄球菌1.5 3.2 1.4枯草杆菌 5.3 8.3 5.8白色念珠菌 39.7 32.9 30.0黑曲霉 25.0 26.9 21.0薄膜过滤法试供试验品稀次释级 数 1 1:10回收率(%)大肠埃希菌 92.1金黄色葡萄球菌92.6枯草杆菌 88.7白色念珠菌 88.0黑曲霉 104.4第 19 页