钙离子浓度在转化生长因子α和β1诱导的体外人卵泡膜细胞凋亡中的变化

1、    钙离子浓度在转化生长因子和1诱导的体外人卵泡膜 细胞凋亡中的变化        【摘要】目的探讨细胞内游离钙离子(Ca2+)浓度与转化 生长因子(TGF)和转化生长因子1(TGF1)诱导的体外人卵泡膜细胞凋亡的关系。方法用TGF和TGF1联合作用诱导体外无血清培养的人卵泡膜细胞发 生凋亡，利用光镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳从形态学、生化指标方面进行凋亡检测，用粘附 细胞分析及筛选激光细胞仪观察细胞内游离Ca2+浓度变化。结果TGF和TGF1联合作用可引起凋亡的人

2、卵泡膜细胞内游离Ca2+浓度 升高。结论Ca2+可能是在TGF和TGF1所致人卵泡膜细胞 凋亡过程中参与信号传递的重要因素。【关键词】细胞凋亡卵泡闭锁人卵泡膜细胞转化生长因子 游离钙Cytosolic Free Calcium Changes in Apoptotic Human Theca Folliculi Cells Induced by Transforming Growth Factor an 1 in VitroLuo JiaLiu JingXing Fuqi（Armed Police Hospital of Guangdong, Guangzhou 510507）【Abstrac

3、t】ObjectiveTo study the relationship between cytosolic free calcium and apoptosis of human theca folliculi cells induced by Transforming Growth Factor (TGF) plus Tran sforming Growth Factor 1(TGF1).MethodsWe detected human theca folliculi cells apoptosis induced by TGF plus TGF1 i n vitro by means o

4、f optical microscope,electronic microscope and agarose gel ele ctrophoresis,cytosolic free calcium changes in apoptotic human theca folliculi cells by Adherent Cell Analysis and Sorting Interactive Laser Cytometer.ResultsCytosolic free calcium in apoptotic theca folliculi cells induced by TGF plus T

5、GF1 increased apparently compared with control groups.ConclusionThis study shows that cytosolic free calcium may par ticipate the signal regulation during apoptosis of human theca folliculi cells i nduced by TGF plus TGF1.【Key words】ApoptosisFollicular atresiaHuman theca folliculi cellTransforming g

6、rowth f actorFree calcium 目前国内关于人卵泡膜细胞凋亡的研究尚属空白，我们的实验研究已经证明TGF和TGF 1同时存在可诱导体外无血清培养的人卵泡膜细胞发生凋亡。为了更深入地了解人卵泡膜细 胞凋亡的信号传递机制，本文应用粘附细胞分析及筛选激光细胞仪观察凋亡细胞内Ca2+ 浓度的变化，以期为今后进一步研究人卵泡膜细胞凋亡的内在调控机制提供初步的研究资 料。1资料与方法1.1研究对象本研究病例为10例具有正常月经周期的子宫内膜癌、子宫颈癌的病人， 年龄3035岁。于 月经周期第914天行根治性子宫切除术时，从切除的卵巢中采取直径约15mm卵泡共26个。 立即置于预冷的PB

7、S液中。术中冰冻及术后病理报告，10例双侧卵巢均无癌细胞转移及病理 性改变。1.2人卵泡膜细胞的获取和培养人卵泡膜细胞的获取和培养参照文献1，2 进行。在无菌条件下，用眼科剪剪开卵泡壁，PBS液缓慢冲洗将颗粒细胞冲洗出卵泡腔，将 剩余的卵泡剪成1mm×1mm的小块，置 于含0.25%胰酶和0.02%EDTA和PBS液中37孵育1015分钟，尽可能去除残余的颗粒细胞 ， 然后将组织块用含1%FBS的PBS液洗2次，用含3g/L胶原酶和5mg/L牛胰腺DNase的PBS孵 育45min，每隔15min用吸管吸弃未消化的组织块。然后将卵泡膜细胞悬液用含1%FBS的DMEM 培养基洗3次，重

8、悬于含10%FBS的培养基中，用台盼蓝染色检测细胞的存活，细胞浓度调至 每亳升3×105个，接种于24孔培养板，每孔0.5ml，37，5%CO2培养。1.3TGF和TGF1诱导体外人卵泡膜细胞凋亡模型的建立参照文献，选择10g/L 作为TGF、TGF1的作用浓度。将培养的卵泡膜细胞分为4组， 每组设4个复孔。细胞培养2小时后，弃去培养液，DHank's液洗2遍，换成无血清培养液。 第13组为实验组分别加入10g/L TGF、10g/L TGF1、10g/L TGF加10g/L TG F1，第4组为正常对照组，37，5%CO2继续培养，于培养后3h、6h、12h、24h，动态观

9、 察细胞形态变化。1.4细胞凋亡的检测3普通光镜观察：采用HE染色法。透射电镜观察 。生化指标检测：提取细胞DNA，进 行琼脂糖凝胶电泳检测。1.5凋亡细胞内游离Ca2+浓度变化的研究41.5.1单个细胞内游离Ca2+浓度的动态变化卵泡膜细胞培养2小时后，吸去培养 基，DHank's液洗3次，加入50 l20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小时，DHa nk' s液洗3次，加入0.5ml DHank's液，上粘附式细胞仪，预扫描3min。加入TGF及TGF 1，继续扫描20min。测定扫描过程中Ca2+浓度动态变化。1.5.2不同处理组间细胞内游离Ca2+浓度的差

10、异卵泡膜细胞培养2小时后，吸去 培养基，DHank's液洗3次，换成无血清培养基，分别加入TGF、TGF1、TGF加TGF1 ，同时设正常对照组，继续培养24小时，吸去培养基，DHank's液洗3次，加入 50l 20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小时，DHank's液洗3次，加入0.5ml D Hank's液，上粘附式细胞仪，测定各组Ca2+浓度，每组测定34个视野，200个 细胞。整个检测过程中所用试剂不含Ca2+，保证无外源性Ca2+的影响。1.5.3统计学处理数据经ACAS 570微机系统测量获得，以±s表示，将三个实验组分别与对照组进

11、行均数间两两比较。2结果2.1TGF和TGF1作用后卵泡膜细胞的形态学变化2.1.1HE染色光镜观察结果培养2小时后的卵泡膜细胞，加入TGF加TGF1后，约3小 时细胞体积开始缩小，12小时部分细胞变圆、上浮，随时间推移上浮细胞增多，24小时将爬 片生长的细胞经HE染色，光镜下观察可见典型的凋亡形态学改变：细胞体积变小，胞质收缩 、深染，呈淡红色，核染色质浓缩，呈蓝黑色，聚集于核膜下呈境界分明的颗粒块状小体， 可见部分细胞膜出泡以及细胞膜包裹碎裂的核而成的凋亡小体，而TGF和TGF1单独处理 无此作用。2.1.2透射电镜观察结果电镜下观察到正常卵泡膜细胞细胞核为卵圆形，胞质中滑面 内质网发达，

12、线粒体丰富，嵴多呈管状，高尔基复合体及脂滴广泛分布。而本研究TGF加T GF1诱导的凋亡细胞形态呈染色质浓缩，聚集于核膜下呈境界分明的块状或月形小体，细 胞浆浓缩或细胞核裂解成质膜包绕的碎片，细胞质可见完整的细胞器。2.2TGF和TGF1作用后卵泡膜细胞凋亡的生化指标检测结果体外培养的卵泡膜细胞 经TGF、TGF1、TGF加TGF1作用24小时后，提取细胞总DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，从谱可以看出经TGF加TGF1作用后的细胞DNA谱为180200bp 及其倍数的片段，呈梯子状(ladder)，而单独作用的细胞其DNA谱不呈现梯状带。说明经T GF加TGF1作用后卵泡膜细胞DNA在核小体连接部

13、位发生了断裂。2.3TGF和TGF1诱导的凋亡卵泡膜细胞内游离Ca2+浓度的变化2.3.1卵泡膜细胞内游离Ca2+浓度动态变化荧光标记后，ACAS 570开始动态扫 描 。以处理前预扫描所测得的值为基数1，扫描全过程中所得荧光值与预扫描荧光值的比值则 代表细胞内Ca2+浓度的相对荧光值。本研究结果，负荷TGF加TGF1后，荧光值迅 速升 高，于负荷后70s达峰值为3.4，之后开始下降，第300s降至2.95时出现一平台期，第500s 时又下降，第900s时降至2.0，荧光值为负荷前基值水平的2倍。2.3.2不同处理组间卵胞膜细胞内游离Ca2+浓度的差异TGF组、TGF 1组、TGF加TGF1组

14、及对照组的卵泡膜细胞内游离Ca2+浓度由ACAS 570测定，每组 测定34个视野，200个细胞，荧光值结果以±s表示，见表1 。表1各组TGF和TGF1作用后细胞内游离Ca2+浓 度的荧光值组别细胞数±s对照组280371.32±3.58TGF484388.33±5.26TGF1267362.33±4.36TGF+TGF1173417.35±2.211)注：1)与对照组相比，P0.01 由表1可见，与正常对照组相比，TGF组与TGF1组Ca2+浓度无明 显差异(P0.2)，TGF加TGF1组Ca2+浓度显著升高(P0.01)，表明T

15、G F 和TGF1联合作用能引起卵泡膜细胞浆游离Ca2+浓度升高，而单独作用对Ca2+ 浓度没有影响。3讨论大量的研究证明，细胞内适宜的Ca2+可能通过活化Ca2+依赖的内切核酸酶 激发DNA的降解，Ca2+钙调素依赖性蛋白磷酸化酶的激发也与触发细胞凋亡过程有 关5，另外，Ca2+与细胞骨架的磷酸化和去磷酸化密切相关，造成凋亡细 胞的皱缩、变形、膜出泡等一系列形态学改变，最终死亡6。细胞内Ca2+ 浓度被认为是参与细胞凋亡信号传递的重要因素。研究发现细胞凋亡是卵泡闭锁的根本机制 7。在卵泡闭锁的过程中，颗粒细胞与卵泡膜细胞相继以凋亡的形式消退8 。 许多致凋亡因素可引起凋亡细胞内Ca2+浓度升

16、高，如一些物理因素、毒性因子、细 胞因子、病毒感染及免疫相关机制的作用。这些凋亡过程常伴有凋亡的重要生化标志即染色 质的有控降解，DNA在核小体连接部位断裂为180200bp的亚单位片段或其倍数的片段，其 琼脂糖凝胶电泳呈现梯形谱，此过程被认为与内源性Ca2+、Mg2+依赖性内切 酶(endonuclease)有关5；Arend等还认为，内源性内切核酸酶有选择地被活化 不 仅与DNA的有序断裂有关，且是凋亡时细胞核形态变化的重要原因6。目前对凋亡 过程中的关键内切核酸酶的定性和提取仍是困难的，原因在于活化过程中酶的不稳定性及 在众多凋亡例子中被活化的候选内切酶的多样性。另外，依赖于Ca2+的酶

17、还有钙蛋白 酶(calpain)和谷氨酸转移酶(transglutaminase)，它们被认为分别与细胞骨架紊乱与细胞 皱缩、胞浆蛋白质交联和维持凋亡小体完整、防止细胞内涵物外溢等有关。Bennett9 等研究发现，细胞表面的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)对于凋亡的细胞被 周围的细胞识别及吞噬清除是必不可少的，此过程也是Ca2+依赖的。另外，Ca2+ 还能激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，后者有改变染色质结构的作用，使聚合的核小体 松懈，减弱组蛋白DNA相互接触，以使DNA更易被核酸内切酶接近。可见，胞浆内Ca2+ 的浓度变化是凋亡发生的重要信号机制之一。然而，

18、有一些凋亡的发生过程，却并不依赖 于Ca2+浓度的增加，且细胞内核酸内切酶的活化不被Ca2+激活，而是为Zn 2+所抑制10。事实上，胞内Ca2+增加可导致增殖和凋亡双重改变，其最 终指向取决于 次级信号的有无，若Ca2+增加，未被激活，则不能抑制Ca2+和(或)PKC对核酸 内 切酶的激活作用，造成DNA降解，细胞凋亡；反之，若PKC被激活则凋亡途径被抑制，细胞呈 现增殖状态。这种一个信号调节两种相反过程的现象，体现了细胞功能调控中的节约机制， 也为细胞在不同环境条件下不同的状态提供了解释。本实验应用粘附细胞分析仪及筛选激光细胞仪观察了TGF和TGF1联合作用诱导卵泡膜 细胞凋亡后胞内游离C

19、a2+浓度的变化。ACAS 570是一种比较简单、快速的检测培养细 胞内游离Ca2+的方法，既可动态观察细胞内游离Ca2+浓度的变化，又可反应细 胞形态。本实验所用的荧光探针是Ca2+螯和剂EGTA的衍生物，对Ca2+有较高的 特异性亲和力，其本身不能透过细胞膜，将其接一个酯性基团AM后才能导入细胞中，经细胞 内的非特异性酯酶水解该酶链，释放出Fluo3，Fluo3与胞浆Ca2+结合后可 被488nm波长的激光激发产生荧光，其荧光强度与Ca2+浓度成正比，据此可测定卵泡 膜 细胞内Ca2+浓度及其变化。结果表明，TGF和TGF1联合作用可使胞浆内Ca2+ 浓度快速升高，说明Ca2+参与了TGF

20、和TGF1诱导的体外人卵泡膜细胞凋亡的信 号传递过程。这仅提供了一个初步的研究成果，其内在调控机制还有待继续深入研究。本课题由国家自然科学基金(编号 39670756)资助作者单位：罗嘉（武警广东省总队医院妇 产科广州，510507）刘菁（第一军医大学分子免疫研究所广州，510515）邢福祺（第一军医大学南方 医院妇产科广州，510515）参考文献1，Lobb DK,Skinner MK,Dorrington JH.Rat thecal/interstitial cells produce amitogenic activity that promotes the growth of gran

21、ulosa cells:molecular and c ellular.Endocrinology,1988;55:2092，Christina B,Olsson JH.Regulation of androgen production in cultured hu man thecal cells by insulinlike growth factor and insulin.Fertil Steril,199 3;59:3233，姜泊，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：171 4，张薇，朴英杰，鲍永耀，等.粘附式细胞仪测定巨噬细胞内游离钙的方法.第一 军医大学学报，1994；14(1)：435，Wyllie AH,Arends MJ,Morris RG,et al.The apoptosis endonuclease and its regulation.Semin Immunol,1992;4:3896，Lemaster JJ,Diguiseppi J,Mieminen A,et al.Blebbing free Ca2+ and mi