鼠抗人TCRCD3单克隆抗体的制备及其初步应用

1、鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体的制备及其初步应用     作者：陈宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖 【摘要】  目的 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人CD3 单克隆抗体，并用于T淋巴细胞亚类检测。方法 以本室纯化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，成功地获得1株抗人CD3单克隆抗体。经间接ELISA测定，杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合SDS?PAGE实验考察单克隆抗体对CD3促T淋巴细胞增殖活性的作用。结果杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为20 mg/mL，效价为10-7，并对T淋巴细胞有

2、促增殖活性，检测正常人外周血阳性T细胞百分率为(73±7)。结论制备的抗人CD3单克隆抗体具备较高的纯度和活性，可用于T细胞亚类的检测。 【关键词】  CD3；单克隆抗体；杂交瘤     Abstract: Objective To detect the CD3 positive T lymphocytes subgroup with the monoclonal antibody of mouse anti?human CD3 antigen of T lymphocyte which produced by B lymphocyte hyb

3、ridoma technique. Methods Balb/c mice were immunized with CD3 protein produced in our laboratory, mixed SP2/0 myeloma with spleen cells of the mice, then obtained an anti?human CD3 antigen of hybridoma cell line. The ascitic culture monoclonal antibody titer was determined by indirect?ELISA, the qua

4、ntity and molecular weight were determined by SDS?PAGE. MTT method was contributed to explore its activity of promoting T lymphocyte proliferation. Results The monoclonal antibody quantity of ascitic hybridoma cell was 20 mg/mL and the titer was 10-7. It had an activity of promoting T lymphocyte pro

5、liferation, percentage of T lymphocyte in healthy adult peripheral blood samples was (73±7).Conclusion This results suggest that the anti?CD3 monoclonal antibody had high purity and activity that might be used in the detection of  CD3  positive T lymphocytes subgroup, and could be app

6、lied in T lymphocyte detection.     Key words: CD3;monoclonal antibody; hybridomas    CD3是T淋巴细胞的一个分化抗原，表达于所有成熟T细胞表面，它是由5条肽链非共价结合组成的复合分子，分别称为、和链。其与TCR分子以非共价结合形成一个TCR/CD3复合受体分子，其中TCR是识别异种抗原和自身MHC分子多态性决定族的受体，而CD3分子并不参与抗原识别，它具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。TCR/CD3复合体是T细胞功能和特异性的主要调节者，抗TCR/CD

7、3 单克隆抗体已在基础研究和临床中都被广泛应用。如何制备质量好、产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题。目前用于生产单克隆抗体的方法有2种：利用纯系小鼠生产免疫腹水法和杂交瘤细胞常规体外培养法1,2。鉴于本次试验样品备用于后续的研发，以及腹水法易保持生物学活性、耗时短和易操作等优点，故应用B淋巴细胞杂交瘤技术联合腹水法，制备并筛选了1株抗人CD3 单克隆抗体，并对其特性进行了鉴定和检测，获得较为满意的结果，现报道如下。     1  材料与方法     1.1  材料    

8、; 1.1.1  纯化抗原、抗体与试剂/盒  CD3抗原利用基因重组技术制备，由本室纯化并提供。鼠抗人CD3 单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体,APAAP  Kit 为Sigma 公司产品，50()聚乙二醇（PEG,MW1500）等其余细胞融合、免疫检测、分离纯化和SDS?PAGE电泳试剂，均为进口或进口分装分析纯产品。     1.1.2  细胞株及细胞培养液  小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0细胞系）由中山大学药学院分子生物学实验室保存，7周龄SPF级BALB/c小鼠购自中山大学实验动物中心，许可证号：粤监证字2004A

9、084；完全RPMI1640培养液（含10新生小牛血清）、无血清RPMI1640培养液、HAT培养液和HT培养液由Gibico公司提供。     1.2  方 法     1.2.1  免疫小鼠和骨髓瘤细胞准备  将CD3纯品的蛋白浓度调整为1 mg/mL, 取0.4 mL与等量的福氏完全佐剂混合、乳化,注射于Balb/C小鼠腹腔，每只小鼠0.2 mL。2周后，同样剂量的CD3与等量的福氏不完全佐剂混合、乳化, 加强免疫。 融合前3 d，尾静脉注射100 g CD3蛋白。将小鼠骨髓瘤细胞用完全RPMI16

10、40培养液在培养瓶中进行扩大培养。选择生长旺盛、活力大于95的骨髓瘤细胞，收集于50 mL离心管中，1 000 r/min离心15 min。弃上清液，沉淀细胞用无血清RPMI1640培养液洗涤2次，1 000 r/min离心15 min。用无血清RPMI1640培养液重悬末次沉淀细胞，计数活细胞，配成1×106细胞/mL，以备融合使用。     1.2.2  免疫小鼠脾细胞悬液的制备  无菌条件下取免疫小鼠脾脏，置培养皿中的200目不锈钢网上。加少量无血清RPMI1640培养液，用注射器平端将脾脏轻轻压过钢网，取出钢网，用滴管轻轻吹吸

11、分散细胞。再以RPMI1640培养液洗涤一次，1 000 r/min离心10 min。沉淀细胞重悬于50 mL无血清RPMI1640培养液，计数淋巴细胞，以备融合使用。     1.2.3  细胞融合  取制备好的骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞，以18比例在50 mL离心管中混合，1 000 r/min离心10 min。弃尽上清，轻轻叩松留存管内的沉淀细胞。将细胞、50PEG及无血清RPMI1640培养液均置于37 水浴箱中预温。将50PEG 0.8 mL于1 min内逐滴加入细胞沉淀中，37 水浴箱中静置1 min。逐渐加入预温的无血清RPMI164

12、0培养液30 mL,轻轻摇动试管，5 min内加完。在室温中以1 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀细胞用10 mL含小牛血清的HAT培养液重新悬浮。滴加于预先铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔100 L。置37 、5CO2孵箱培养。     1.2.4  杂交瘤细胞的克隆化  采用有限稀释法。于96孔平底微量培养板制备巨噬细胞培养层3，用一块板作阳性孔杂交瘤细胞的克隆化。收集并计数各阳性孔中的细胞。分别制备细胞数目为20、10、5 /mL的细胞悬液。分别加入96孔培养板，每孔100 L。培养板置37 、5CO2孵箱培养。12周可

13、观察到克隆生长。检测上清中的抗体，将阳性孔中杂交瘤细胞再次选出培养并作克隆化。    1.2.5  杂交瘤细胞系的建立与维持  每只小鼠腹腔内注射0.5 mL降植烷。7 d后于小鼠腹腔内注射1×106杂交瘤细胞，2周后大多数可产生实体瘤和腹水。用注射器抽出腹水，在4 以2 000 r/min离心15 min，备用腹水冻存于-70 。小鼠存活期间可重复上述最后一步。     1.2.6  单克隆抗体的提取与纯化4  取上述收获的腹水加等量PBS，于搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸

14、铵。 冰浴30 min，2 500 r/min,30 min，使其充分沉淀。将所得沉淀物以1 mL PBS溶解至装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色。将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以紫外分光度计测蛋白含量。单克隆抗体的进一步纯化按照Protein A Agrose说明书进行。SDS?PAGE （10的分离胶和5的浓缩胶）结合分光光度计检测样品浓度。间接ELISA法检测收集腹水的效价。     1.2.7  纯化抗CD3 单克隆抗体刺激T细胞活化的活性检测  采用MTT法。采集肝素抗凝的正常人静脉血,

15、以Ficoll?Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞, 再以尼龙毛柱法分离纯化T细胞。取100 L(1×109细胞/L ), 用流式细胞仪分析T细胞的纯度，其余用于刺激T细胞活化的活性分析。96孔板上用羊抗鼠IgG包被（50倍稀释，加50 L/孔）：加入50倍PBS稀释羊抗鼠IgG 50 L/孔，4 过夜。弃上清。加入1BSA（PBS稀释）100 L，37，3 h，弃上清用PBS洗2次。4 保存。RPMI1640培养液稀释纯化的单克隆抗体（设110、1100、1500三个稀释度），每孔100 L，以培养基为对照组，设3个复孔，向各孔中分别加入100 L的T淋巴细胞悬液（2

16、×104），37 、5%CO2培养。72 h后，取培养板每孔加MTT液20 L，继续培养4 h，2 500 r/min离心10 min，弃上清培养液，每孔加Formazan裂解液100 L，待其沉淀溶解，在测定波长570 nm，参比波长630 nm下测定吸光度。     1.2.8  碱性磷酸酶?抗碱性磷酸(APAAP)桥联酶标法测定T细胞亚群5,6  常规法Ficoll?Hypaque密度分离法，分离健康人外周血单个核细胞，洗涤后用含10()FCS的PMI1640调整细胞浓度至 1×10mL。桥联酶标法操作安装说明书进行：

17、取100 L细胞悬液滴加在干净载玻片上，风干，用纯丙酮固定。PBS洗3次，每次2 min,干燥，用蜡笔画圈标记细胞所在位置。加一抗（自制鼠抗人单克隆抗体）10 L，37 湿盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加二抗150羊抗鼠IgG 10 L，37 湿盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(12 000)复合物10 L。37湿盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加碱性磷酸酶底物10 L，37 湿盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。Mayer苏木精复染1 min，自来水下冲洗,镜检。   

18、0; 2  结果与分析     2.1  单克隆抗体的制备     应用B淋巴细胞杂交瘤技术，进行4次细胞融合，平均融合率约 95%。将所得阳性克隆孔进行有限稀释克隆化45次，直到亚克隆的阳性率均达到100%。最后获得1株杂交瘤细胞。经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，分泌抗体水平未见下降。说明已是稳定分泌鼠抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     2.2  单克隆抗体含量测定     将杂交瘤细胞的腹水和精制单克隆抗体10 L进行SDS?

19、PAGE（如图1），可见重链和轻链的分子量分别为55和25 kD的条带。用先盐析后透析，然后再用Protein A Agrose纯化，单克隆抗体浓度为20 mg/mL; 所得纯品经10倍逐级稀释，用间接ELISA法检测腹水的效价为1×10-7。     2.3  抗CD3单克隆抗体刺激T细胞活化的活性分析     以Ficoll?Hypaque 密度梯度离心法分离 PBMC, 再通过尼龙毛柱法纯化 T细胞， 用 FITC标记的抗 CD3 单克隆抗体进行流式细胞术分析。结果表明, T细胞的纯度为 86.9 %。用纯化

20、的单克隆抗体刺激纯化的T细胞, 同时设阳性及阴性对照, 作用72 h后， 加入 MTT液继续培养4 h，收集细胞, 测定吸光度。结果显示与对照组相比, 抗 CD3 单克隆抗体具有明显的 T细胞刺激活性。     24  桥联酶标法测定T细胞亚群     通过对空白对照和试验组玻片的显微镜镜下观察，计数100个细胞，可计算出阳性细胞率。镜下可见（如图2）阳性细胞细胞膜上或胞质着色为红色，胞核为蓝色（箭头1所示）。阴性细胞细胞膜上或胞质着色为无色，胞核为蓝色（箭头2所示）。统计学分析得出CD3阳性T细胞百分率(n=20，

21、7;s)为（73±7）。     3  讨 论     自第一个T细胞CD3分子特异性的单克隆抗体 OKT3在首届国际白细胞分化抗原会议上得到公认以来，目前许多实验室已生产出众多抗TCR/CD3复合体分子的单克隆抗体，不同的单克隆抗体在亲和力、免疫球蛋白类和亚类及其特异性上不尽相同。     本研究以基因重组表达CD3为免疫原，加佐剂进行基础免疫后，经融合、筛选及克隆化，得到1株分泌抗CD3 单克隆抗体的杂交瘤细胞。取之连续3次克隆化后达100阳性。用此杂交瘤细胞制备的腹水效价为 10

22、-7。该细胞株经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，其分泌单克隆抗体的能力不变,表明上述方法免疫成功。为了获得高纯度的单克隆抗体，采用了盐析和透析相结合的方法。考虑到蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故将腹水以PBS作等倍稀释后再盐析。离子强度也可影响蛋白质沉淀，当硫酸铵饱和度为33时球蛋白析出。实验还发现蛋白沉淀后宜在4过夜，更易于形成较大沉淀而易于分离。抗 CD3 单克隆抗体蛋白的检测采用Western blot法7。取抗CD3 单克隆抗体进行SDS?PAGE，再用 Bio?Rad公司的蛋白转印系统，转印至硝酸纤维素膜上,以HRP?mMcAb?CD3进行检测, 经相应试剂盒鉴定本单克隆抗体的重链为小鼠IgG2a亚类，轻链为型。T细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成8，由于它在胸腺内分化成熟故称为T细胞。成熟T细胞由胸腺迁出，移居于周围淋巴组织中淋巴节的副皮质区和脾白髓小动脉的周围。不同