银杏叶提取物对大鼠肝星状细胞细胞因子和胶原合成及细胞增殖的影响(1)_图文

1、论著银杏叶提取物对大鼠肝星状细胞细胞因子和胶原合成及细胞增殖的影响主余华张春清石军任万华马艳丽【摘要】目的研究银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机理。方法用不同浓度(0,1,10,100,500g m l -1的银杏叶提取物处理HSC 2T6细胞24h 和48h,采用RT 2PCR 法检测各组细胞转化生长因子1(TGF 21、结缔组织生长因子(CTGF 、型胶原、型胶原mRNA 的表达;应用流式细胞仪检测细胞增殖周期的变化。结果银杏叶提取物在10,100,500g m l -1浓度能明显抑制TGF 21、CTGF 、型胶原、型胶原mRNA 的表达(P <0.01或P <0.05,在一定范

2、围内呈剂量和时间依赖性,影响HSC 2T6的细胞周期,降低其增殖活性。结论银杏叶提取物可明显抑制HSC 2T6细胞的增殖,抑制细胞因子及细胞外基质成分基因的表达,由此发挥抗肝纤维化的作用。【关键词】肝星状细胞银杏叶提取物转化生长因子2结缔组织生长因子胶原大鼠Effect of g i n ko b iloba extract on the expressi on of cytok i n es and coll agen and cell proli fera ti on i n ra t hepa ti c stell a te cellsZhu Yuhua,Zhang Chunqing,S

3、hi Jun,et al .Center of L iver D iseases,Provincial Hospital,Shandong U niversity,J inan,Shandong250021,China【Abstract 】O bjecti ve T o investigate the effect of ginko bil oba extract (GbE on the ex p ressi on of cyt okines and collagen and cell p r oliferati on in HS C 2T6cell line .M ethods HS C 2

4、T6cells were cultured with GbE at different dosages (1,10,100,500g m l -1and without GbE as contr ol .The ex p ressi on of transfor m ing gr o wth fact or 1(TGF 21,connective tissue gr o wth fact or (CTGF ,ty pe I and ty pe collagen mRNA were deter m ined by reverse transcri p ti on 2poly merase cha

5、in reacti on (RT 2PCR after 24hour and 48hour culture .The cell cycles were analyzed by fl o w cyt o metry .Results GbE do wn 2regulated the ex p ressi on of TGF 21,CTGF,ty pe and ty pe collagen mRNA in HS C 2T6cells (P <0.01or P <0.05.The effect was on a dose and ti m e dependent manner .And

6、it inhibited the p r oliferati on of HS C 2T6cells .Conclusi on s GbE could exert the inhibit ory effect on HS C 2T6cells bydo wn 2regulating the ex p ressi on of TGF 21and CTGF .【Key words 】Ginko bil oba extract Hepatic stellate cell Transf or m ing gr owth fact or 1Connective tissue gr owth fac 2t

7、 or Collagen Rat3基金项目:2003年山东省博士基金资助项目(03BS016作者单位:250021济南市山东大学山东省立医院肝病中心通讯作者:任万华男,43岁,副主任医师,博士学位,0531286892869,E 2mail :zyh6698yahoo 近年来,动物实验与临床观察均表明银杏叶提取物可用于治疗肝纤维化,并能取得较好的疗效。本文通过观察银杏叶提取物(GbE761对大鼠肝星状细胞(HSC 转化生长因子1(transfor m ing gr owth fact or 1,TGF 21、结缔组织生长因子(connective tissue gr owth fact or,

8、CTGF 、型胶原、型胶原mRNA 表达及其对细胞增殖的影响,来探讨银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机理。材料与方法一、材料大鼠肝星状细胞株HSC 2T6由上海中医药大学肝病研究所提供;DME M 培养基购自Gibico公司;新生小牛血清购自杭州四季青公司;RT 2PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司,RNA 抽提试剂T R I Z OL 购自上海生工公司;检测TGF 21、CTGF 、型胶原、型胶原、G AP DH 引物由上海博亚生物技术有限公司合成;银杏叶提取物复合针剂(杏丁由贵州益佰医药有限公司提供。二、细胞培养将HSC 2T6细胞用含10%小牛血清的DME M 培养。试验前24小时传代接种

9、于100m l 培养瓶中,按GbE761药液药物终浓度分为A 组:500g m l -1;B 组:100g m l -1;C 组:10g m l -1;D 组:1g m l -1和E 组:空白对照组(仅用DME M 培养液培养。继续分别培养细胞24h 和48h 后,进行总RNA 提取。每组实验重复3次。三、RT PCR 反应按细胞总RNA 抽提试剂盒方法提取细胞总RNA;按RT2PCR说明书进行逆转录聚合酶链式反应。PCR反应条件为94预变性2m in; 94变性45s,57退火45 s,72延伸45s,28个循环, 72再延伸10m in。G AP DH 引物:上游5T CCCTCAA2 G

10、 ATTGT CAGCAA3,下游5AG ATCCA2 CAACGG AT ACATT3,扩增长度:300bp。CTGF引物:上游5CCTG ACCCAACT AT2 G ATGC3,下游5CCCT2 T ACTCCCTGGCTTT3,扩增长度499bp。TGF21上游5CGGCAGCTGT ACATTG ACTT3,下游5AGCGCACG AT2 CATGTTGG AC3,扩增长度271bp。I型胶原引物:上游5TGCCGTG ACCTCAAG AT2 GTG3,下游5CA2 CAAGCGTGCTGT AGGTG A 3,扩增长度462bp;III型胶原:上游5G AGCG2 G AG AA

11、T ACTGGGTT3,下游5CAATGT CAT AGGGT2 GCG AT A3,扩增长度529bp。取PCR产物10l用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,同时以100bp Ladder为DNA markers,紫外线灯下观察,以出现499、462、529、271和300bp分别表示为CTGF、I 型胶原、型胶原、TGF21和G AP DHmRNA阳性结果,应用A l pha I m ager2200分析软件对凝胶电泳图进行扫描分析,以曲线下峰面积作为PCR产物含量,用TGF21mRNA、CTGF mRNA分别与G AP DH mRNA积分值之比,表示该基因mRNA表达水平。四、流式细胞仪测定细

12、胞周期时相各组细胞培养24小时后消化收集细胞,送流式细胞仪检测细胞周期。五、统计学处理所有数值以x±s表示,使用SPSS11.5软件包进行方差分析及两样本比较的t检验,P<0.05为有统计学意义。结果一、各组PCR产物电泳结果分别以各组细胞总RNA为模板,进行RT PCR反应,产物经凝胶电泳可见499、462、529、271和300bp处CTGF、I型胶原、型胶原、TGF21和G AP DH的清晰扩增条带,结果见图1图8 。图1细胞培养24h后各组CTGF、I型胶原、G AP DH mRNA电泳结果图2 细胞培养24h后各组型胶原、TGF21、G AP DH mRNA电泳结果图

13、3 细胞培养48h后各组CTGF、I型胶原、型胶原、G AP DH mRNA电泳结果图4细胞培养48h后各组TGF21、G AP DH mRNA电泳结果二、GbE761对TGF21mRNA表达的影响与空白对照组比,A、B、C三组TGF21mRNA相对表达量降低,24h各组表达分别下调45%±3%、39%±4%和28%±4%(P<0.01;48h各组表达分别下调54%±3%、49%±3%和35%±4%(P<0.01,而D 组对TGF21mRNA表达均无明显作用。48h各组TGF21mRNA相对表达量低于24h各组,其中A、B

14、、C 三组48h TGF21mRNA相对表达量明显低于24h表达量(P<0.01或P<0.05。因此,银杏叶提取物可明显抑制TGF21mRNA的表达,且在一定范围内随着剂量及时间的增加,其抑制效率逐渐增加。三、GbE761对CTGF mRNA表达的影响与空白对照组比,A组、B组及C组CTGF mRNA相对表达量降低,24h各组分别下调56%±3%、45%±4%、29%±6%(P<0.01;48h各组分别下调69%±3%、57%±4%、48%±6%(P<0.01,而D组与对照组比均无明显差异(P>0.05;

15、48h各组CTGF mRNA表达量低于24h各组表达量,其中A、B、C组对CTGF mRNA 抑制效率明显高于24h各组(P<0.01或P<0105。因此,银杏叶提取物可明显抑制CTGF mRNA表达,且在一定范围内随着剂量及时间的增加,其抑制效率逐渐增加。四、GbE761对I型胶原mRNA表达的影响与空白对照组比,A、B、C组I型胶原mRNA相对表达量降低,24h各组表达分别下调29%±3%、23%±4%、13%±4%(P<0.01;48h各组表达分别下调40%±3%、30%±3%、19%±4%(P<0.01

16、,而D组对I型胶原mRNA表达均无明显作用;A、B、C三组48h I型胶原mRNA相对表达量低于24h表达量(P<0.05或P<0.01。因此,银杏叶提取物可明显抑制I型胶原mRNA的表达,且在一定范围内随着剂量及时间的增加,其抑制效率逐渐增加。五、GbE761对型胶原mRNA表达的影响与空白对照组比,A组、B组及C组型胶原mRNA相对表达量降低,24h各组表达分别下调31%±3%、26%±4%、20%±4%(P<0.05;48h各组表达分别下调40%±3%、30%±3%、23%±4%(P<0.01,而D组对型

17、胶原mRNA表达均无明显作用;A、B、C三组48h型胶原mRNA相对表达量低于24h表达量(P <0.05或P<0.01。因此,银杏叶提取物可明显抑制型胶原mRNA的表达,且在一定范围内随着剂量及时间的增加,其抑制效率逐渐增加。六、24h GbE761对细胞周期的影响流式细胞仪检测表明,培养的HSC在加入G BE761后,随其浓度的增加,G0/1期DNA含量逐渐增加,其中A、B、C组明显高于E组(P<0.05或P<0.01,S期DNA含量 则逐渐降低,其中A、B、C组明显低于E组(P< 0101,反映细胞增殖活力的增殖指数(P I则逐渐降低,其中A组、B组、C组与

18、E组比有明显差异(P< 0105或P<0.01,说明GbE761能阻滞细胞进入S 期,停滞于G O/1期(表1。表1各组细胞周期时相百分比(n=3,x±sGbE761(gm l-1G1S P IE组051.8±2.248.2±2.148.2±2.2D组154.6±2.344±2.345.4±2.3C组1057.8±2.335.9±2.242.2±2.2B组10059.5±2.436.7±2.440.5±2.4A组50062.2±2.435.1&

19、#177;2.337.8±2.3与E组比,P<0.05,P<0.01讨论肝纤维化是胶原等细胞外基质过度沉积的结果, TGF21是促肝纤维化最重要的细胞因子,可以显著促进胶原的合成1。CTGF是新近发现的一种生长因子,被认为与TGF21有密切关系2,它在许多组织器官纤维化时表达明显增高,其在肝纤维化发生中的作用逐渐受到关注3,4。银杏叶提取物(GbE主要药理成分为黄酮苷和银杏内酯,具有广泛的生物学作用,主要包括清除氧自由基、抑制脂质过氧化和改善微循环等。近年来,动物实验研究发现,银杏叶提取物可促进大鼠肝纤维化的逆转,使肝组织中2S MA,TGF21,I 型胶原,TI M P

20、21的表达降低,使肝组织纤维化程度减低,胶原纤维、网状纤维显著缩小58,改善肝功能。HSC2T6为经S V40转染Sp rague2Da wley大鼠肝星状细胞而来,可表达高水平胶原9。本研究证实, HSC2T6可高度表达TGF21、CTGF、型胶原、型胶原mRNA。我们使用不同浓度梯度的银杏叶提取物作用于体外培养的HSC2T6,结果发现,较高浓度的GbE761可明显抑制肝星状细胞的生长,抑制其增殖活性,使细胞停滞于G0/1期,S期细胞明显减少;并能够明显抑制HSC2T6中TGF21、CTGF、型胶原及型胶原基因mRNA表达,且在一定范围内随剂量及时间的增加,其抑制效率逐渐增加。本实验在基因水

21、平发现,银杏叶提取物能够明显下调HSC2T6中TGF21、CTGF基因mRNA及胶原的表达,而对胶原的抑制作用相对小于对TGF21和CTGF mRNA的抑制作用,这为银杏叶提取物可能应用于抗纤维化治疗提供了分子生物学依据。“TGF212CTGF2细胞外基质”这一通路存在于肝星状细胞的活化中,CTGF作为TGF21的下游效应因子,其生物学效应相对局限于促进纤维化的发生和发展,因此抑制其表达活性可能是一种更有效、更特异的防治肝纤维化手段。银杏叶提取物很可能是通过抑制肝星状细胞的增殖,从而抑制TGF21的表达来下调CTGF的表达,进而抑制胶原的表达,发挥抗纤维化的作用,但是否也能直接抑制CTGF基因

22、的表达,从而发挥其抗肝纤维化的作用,需要进一步的研究证实。参考文献1CZ AJA MJ,W E I N ER FR,F LANDERS KC,et al.I n vitr o andin vivo ass ociati on of transfor m ing gr owth fact or2beta1withhepatic fibr osisJ.J Cell B i ol,1989,108(6:2477282. 2CHE N MM,LAM A,ABRAHAM J A,et al.CTGF exp res2si on is induced by TGF2beta in cardiac fibr

23、 oblasts and car2diac my2ocytes:a potential r ole in heart fibr osisJ.J MolCell Cardi ol,2000,32:180521819.3G UPT A S,CLARKS ON MR,DUGG AN J,et al.Connectivetissue gr owth fact or:potential r ole in gl omerul oscler osis andtubul ointerstitial fibr osisJ.Kidney I nt,2000,58:138921399.4G OLDSCHME D I N G R,ATE N J,I T O Y,et al.Connective tis2sue gr owth fact or:just another fact or in renal fibr osisJ.Nephr ol D ial Trans p lant,2000,1