黑芝麻提取物促B16黑素瘤细胞黑素合成及其机制的研究

1、黑芝麻提取物促B16黑素瘤细胞黑素合成及其机制的研究         10-09-01 11:34:00     编辑：studa20               作者：姜泽群，徐继敏，吴琼，何光源【摘要】  目的 研究黑芝麻的水提取物对B16黑素瘤细胞系酪氨酸酶活性、黑素合成及相关基因和蛋白表达的影响，探讨黑芝麻促进黑色素合成

2、的可能机制。方法选择3种浓度(0.5,1,2 mg/ml)的黑芝麻水提物作用于B16黑素瘤细胞72 h，观察其对黑素细胞的增殖、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。免疫印迹法和半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测药物作用48 h前后酪氨酸酶(Tyrosinase)、小眼相关转录因子(microphthalmia associated transcription factor，MITF)，酪氨酸酶相关蛋白酶1(TRPl)和酪氨酸酶相关蛋白酶2(TRP2)蛋白和mRNA表达水平的变化。结果3种浓度的黑芝麻水提物可轻微促进B16细胞的增殖(P> 0.05);试验浓度范围内可明显促进B1

3、6细胞黑素合成和酪氨酸酶活性增加( P< 0.05)，并以浓度依赖方式促进酪氨酸酶和MITF的蛋白和mRNA表达( P< 0.05)，但对TRP-1、TRP-2的表达几乎没有影响(P > 0.05)。结论黑芝麻水提物在体外能直接刺激B16黑素瘤细胞黑色素的合成，上述变化可能通过促进酪氨酸酶和MITF的基因转录和蛋白表达作用来完成。 【关键词】  黑芝麻水提物; 酪氨酸酶(Tyrosinase); 黑素; 小眼相关转录因子(MITF); 酪氨酸酶相关蛋白酶1(TRPl); 酪氨酸酶相关蛋白酶2(TRP2)Abstract：ObjectiveTo study the e

4、ffect of water extract from Semen Sesami Nigrum (WES) on cell viability,tyrosinase activity and melanogenesis of B16 murine melanoma cells and to clarify the mechanism of its stimulating effect on melanogenesis.MethodsThree different concentrations of WES were incubated with B16 cells for 72h and th

5、en cell viability, melanin content，tyrosinase activity were respectively measured. The protein and mRNA expression of melanogenesis key enzymes were investigated by western blot and RT-PCR after 48 h treatment of WES.Results Three different concentrations of WES slightly increased cell viability (P&

6、gt; 0.05). In the range of experimental dose，WES increased the activity of the tyrosinase and melanin content significantly in a dose-dependent manner( P< 0.05). The increasing mRNA and protein expression of TYR and MITF were also observed in a dose-dependent manner( P< 0.05).Almost no effect

7、was observed on the expression of TRP1 and TRP2(P> 0.05).Conclusion WES can directly stimulate melanogenesis in B16 melanoma cells, which may be induced by increasing expression of TYR and MITF on mRNA and protein levels.Key words：Water extract from Semen Sesami Nigrum; Tyrosinase; Melanin; Micro

8、phthalmia associated transcription factor(MITF); Tyrosinase-related protein-1(TRPl); Tyrosinase-related protein-2(TRP2)黑芝麻是我国传统的滋补食品，有显著的医疗保健功效。早在几千年前的本草纲目中对黑芝麻的功效就有描述：补肝、益胃、精血、润肠、生津、明目、乌发、降压。近年来有研究表明黑芝麻对酪氨酸酶的激活及促黑色素生成方面均具有较强的作用1,2，但其分子机理尚不清楚。本实验通过检测黑芝麻水提物对细胞的增殖活性、黑素含量及酪氨酸酶活性的影响，并进行黑素合成的相关基因(Tyrosin

9、ase/MITF/TRP-1/TRP-2) mRNA和蛋白质表达的测定，从细胞和分子水平上探讨黑芝麻促进黑色素生成的作用机制及对白发治疗的可能性。1 材料1.1 试剂 左旋多巴(L-DOPA)，DMSO，DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Trizol(Invitrogen Life Technologies)，PCR试剂盒和RT-PCR试剂盒PCR引物购自北京奥科生物技术公司(均购自宝生物大连公司)，多克隆兔抗人酪氨酸酶(Tyrosinase)抗体、多克隆兔抗人MITF抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶1(TRPl)抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶2(

10、TRP2)抗体和兔抗人肌动蛋白多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自美国Santa Cruz公司，其他为国产分析纯试剂。1.2 药物的提取 实验用黑芝麻由武汉中医协会陈昌一医生鉴定，提取方法采用索氏提取法，水提后真空冷冻干燥，用DMSO配成所需浓度的黑芝麻水提物溶液。1.3 细胞培养 B16黑素瘤细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。用含10%胎牛血清的DMEM培养基37 ,5%CO2条件下常规培养,待细胞生长至近融合状态，0.25%胰蛋白酶消化，以每瓶约105个细胞传代，每3天传代1次。2 方法2.1 细胞增殖的测定 甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)3将配制的细胞悬液调整细胞浓度为2&

11、#215;104/ml加入96孔培养板，每孔100 l，再分别加入不同浓度药物(终浓度为(0.5,1,2 mg/ml)，每一浓度设立3个复孔，取平均值，并设置培养基为对照组。药物作用3 d后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 l，37°C孵育4 h。弃去上清液,每孔加二甲基亚砜100 l，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测各孔吸光度值，以空白孔调零。细胞活力增殖率(%)=(各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%。每一处理因素重复测定3次。2.2 酪氨酸酶活性测定4将配制的细胞悬液调整细胞浓度为7×104/ml加入96孔培养板，每孔10

12、0 l，以L-Dopa为底物，药物作用3 d后，弃去上清液， 用pH 7.4的PBS洗涤两次，每孔加1%Triton X-100溶液90 l，迅速放入-80 低温冰箱冻存1 h，随后室温融化使细胞裂解，37 预温后加入1%L-多巴溶液(10 l/孔)，37反应1 h，测定490 nm吸光度值，以培养基为对照组。每一浓度设立3个复孔，取平均值。酪氨酸酶活性激活率(%)=(各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%。每一处理因素重复测定3次。2.3 黑素含量测定4 将培养的第34代黑素细胞以1×104 个/cm2 密度接种于6孔板，24 h后换液，再分别加入不

13、同浓度药物(终浓度为0.5,1,2 mg/ml) 作用3 d后，收获细胞,离心后用PBS洗涤两次，加入1 mol/L NaOH，置80 水浴中30 min使细胞团块完全溶解,并用双蒸水将NaOH的终浓度稀释至0.2 mol/L。用分光光度计在400 nm测定A400值。黑素含量用每个细胞加药处理组A400值占空白对照组A400值的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。2.4 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定酪氨酸酶及其相关蛋白mRNA的表达采用Trizol方法(参照试剂说明书)提取用上述浓度的黑芝麻水提物处理48 h的B16鼠黑素瘤细胞株的总RNA。引物设计参照Hyeong Jun

14、 Kim5 。 Tyrosinase: 上游,5-GGCCAG CTT TCA GGC AGA GGT-3; 下游,5-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3。TRP-1:上游, 5-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3; 下游, 5-AAG ACG CTG CAC TGC TGGTCT-3。TRP-2: 上游, 5-GGA TGA CCG TGAGCA ATG GCC-3; 下游, 5-CGG TTG TGACCA ATG GGT GCC-3。 MITF: 上游, 5-AAG TGG TCTGCG GTG TCT CC-3; 下游 5-GTT GTT

15、 GGTAAA GGT GAT GG-3。 -actin: 上游,5'-CGA GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA GGA GA-3;下游,5'-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3。将提取的RNA反转录成cDNA用于PCR扩增，PCR的反应条件为: 94°C 60 s, 56°C 60 s, 72°C 60 s (26个循环)或20个循环(-actin)。在含EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下拍照然后用凝胶成像系统分析，读取cDNA荧光强度值，再与对照组相比即为其mRNA相对表达量。2.5 蛋白质免疫印迹 黑素细胞培养24 h后，用上述浓度的黑芝麻水提物处理48 h。用刮法收集黑素细胞，溶于Triton X一100裂解缓冲物，超声波裂解和涡漩，12 000 r/min ，离心10 min，取上清液1 l加到800 l 和200l染料(Dye Reagent，Bio-Rad)混合，读取A595值。根据标准曲线计算蛋白浓度，取20 l进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V，电泳2 h后转移到硝酸纤维素膜，100 mA，2 h。取膜，封闭液4 °C封闭过夜，洗膜10 min 3次，加入(110 00)多克隆兔抗人酪氨酸酶(Ty