三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

1、三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究         11-01-07 13:18:00     编辑：studa20                作者：阮禹松，万明习，李晓华【摘要】  目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF7的生长抑制作用，并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制。方法 MCF7细胞

2、在含25mol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养17d后，进行MTT实验，测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分，并应用双向电泳方法对其进行分离，以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析，找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定。结果 25mol/L的三羟异黄酮对MCF7细胞具有明显的抑制作用，并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离，并成功鉴定出24种差异表达蛋白，其中5种下调，19种上调。结论

3、 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面。 【关键词】  乳腺癌;蛋白质组学;顺序抽提;双向电泳;基质辅助激光解吸离子化电离飞行时间质谱;三羟基异黄酮ABSTRACT: Objective To investigate the inhibitory effects of low concentration of genistein on human breast cancer cell line MCF7 and explore its molecular mechanism using proteomic technologies. Methods L

4、og phase cells were cultured in 96well plates at a density of 1×103 cells/well with 25mol/L genistein for 1 to 7 days respectively to obtain growth curve by MTT assay. Sequential protein extraction was used and proteins were fractionated as soluble or hydrophobic fractions which were then analy

5、zed by 2DE. Spots were detected and evaluated by 2D platinum Software 5.0 and the spots with different expression level were subjected to MS analysis. Results Genistein of 25mol/L obviously inhibited the growth of MCF7 cells and could induce apoptosis of the cells after 4 days cultivation; 2DE patte

6、rns demonstrated a good resolution either for soluble proteins or for hydrophobic proteins. Moreover, 24 significant proteins were identified, among which 19 were upregulated and 5 were downregulated. Conclusion These proteins functions are involved in many aspects of cell physiological functions su

7、ch as growth regulation, stress response, cell morphogenesis and apoptosis.KEY WORDS: breast cancer; proteomics; sequential extraction; twodimensional electrophoresis(2DE); matrixassisted laser desorption/ ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); genistein目前有许多学者对三羟基异黄酮的抑癌作用进行了大量的研究，其

8、作用机制涉及了雌激素受体调节作用、抑制类胰岛素生长因子、酪氨酸蛋白激酶以及拓扑异构酶II活性等多个方面14。由于三羟基异黄酮与雌二醇分子结构存在很大的相似性，以往常将其抗癌能力归结为性激素调节作用。然而大量地体外实验表明高浓度(50mol/L)的三羟基异黄酮对依赖雌激素的乳腺癌细胞系和不依赖雌激素的乳腺癌细胞系都表现出生长抑制效应5，而且三羟基异黄酮还是表皮生长因子受体的一个强有力的抑制剂(其半抑制浓度为2.6mol/L)。然而三羟基异黄酮并不阻碍DU145前列腺癌细胞系EGFR的磷酸化及活化6，这一点也在其他的癌细胞系中得到了证实。此外，极低浓度(1nmol/L10mol/L)的三羟基异黄酮

9、还能刺激MCF7细胞(雌激素受体阳性)生长，但对MDAMB435乳腺癌(雌激素受体阴性)细胞系却无此效应7。这些研究结均果提示三羟基异黄酮的抗癌效应有其他途径的存在。以往的研究方法(如免疫沉淀法)往往只考虑到一个或少数几个蛋白或mRNA的变化，不可避免地存在一定的局限性和片面性。事实上任何生理、病理变化或药物影响的结果都与蛋白质的组成和量的改变密切相关。因此，只有对蛋白质的种类和数量进行整体、全面、动态的考察(即蛋白质表达谱)，才能更准确、灵敏地反映出肿瘤的性状和生物学行为。所以，本文试图通过对三羟基异黄酮作用下的MCF7细胞蛋白质表达谱的分析，以阐明三羟基异黄酮的作用机制。1 材料与方法1.

10、1 试剂 三羟基异黄酮(genistein)、曲拉酮(Triton X100)、碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、胰酶(TPCKtrypsin)、尿素(urea)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、氰基242羟基肉桂酸(CHCA)均购自Sigma(Taufkirchen, Germany)公司;丙烯酰胺单体、甘氨酸、矿物油、IPG胶条(pH 310, 47以及611)、低分子量标准、IPG buffer (pH 310，47以及611)和Protease Inhibitor Mix均购自Amersham Pharmacia Biotech公司(Uppsala

11、, Sweden);二甲基亚砜(DMSO)、三氟乙酸、Tris碱、乙醇、乙腈以及三丁基磷(tributyl phosphine TBP，体积分数85%)购自Fluka(Buchs, switzerland);Dulbeccos modified eagle medium (DMEM)培养液、小牛血清、牛胰岛素、磷酸盐缓冲液购自Hyclone(Utah, America)。所有溶液均用超纯水(来自MilliQ)配制。1.2 主要仪器和设备 IPGphor 等电聚焦仪(GE公司);UP 200S超声破碎仪(Dr. Hielscher GmbH);Ult rospec 2100proUV(Amers

12、ham Bioscience);Hoefor SE600垂直电泳仪(Amersham Biosciences);ScanMaker 8700扫描仪(MICROTEC);Model 250 pH计(Thermo Orion);Milli Q超纯水发生器(Millipore);VoyagerDETM MALDITOF质谱仪(Applied Biosystems);CentriVap Concentrator(Labconco公司);凝胶图像分析软件ImageMaster 5.0(Amersham Biosciences公司);超速低温离心机3K30(德国Sigma公司);CO2细胞培养箱(REVC

13、O2 EL ITE22);倒置显微镜IX70(Olympus);BP800(BIOHIT)酶标仪。1.3 方法将水溶性蛋白组分和洗脱后的膜样品用裂解液(7mol/L urea，2mol/L thiourea，40g/L CHAPS，5mL/L Triton X100，10mL/L IPG buffer，5mmol/L TBP，10mL/L Protease Inhibitor Mix和20mmol/L Tris)溶解，4震荡1h后，20000×g离心1h，将上清(上清吸取时要小心避开液体表面的脂质层)转移到另一个离心管中。定量，60g分装，保存于-80。Pharmacia, Swed

14、en)软件进行分析。点检测参数设置如下：首先，将Smooth parameter调整为2.5使得所有真正的点均可被检测，然后，将minimum area设置为10 pixels 以消除面积小于该值的点。最后，根据实际情况调整saliency parameter参数以消除假点(本实验中该值为1)。保留这些参数用于所有本实验中需要比较的2DE凝胶图。为了更能准确地反映实验和对照组在蛋白质表达量上的差异，我们将其各自3次重复的胶组合成平均胶，再相互比较计算对应蛋白质点之间量的关系。2 结 果2.1 三羟基异黄酮的生长抑制作用 为了探究低浓度的异黄酮对MCF7细胞是否具有生长抑制作用，我们用含25mol/L异黄酮的培养液将MCF7细胞在96孔板里培养07d，分别进行MTT分析(图1)。结果表明从加入异黄酮后的第2天开始，25mol/L的异黄酮对MCF7就具有明显的生长抑制作用。其抑制效果可达正常生长的50%左右。另一方面，我们将对数生长期的MCF7细进行了同样浓度的培养以观