cell culture

1、2022-1-3012022-1-301International Graduate School in Molecular Medicine UlmUlm University细细胞胞培培养养郑郑红红云云 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm传代细胞的培养传代细胞的培养 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞（N

2、2a，N2atau，SK-N-SH，293wt，293tau）。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。我们科里未分化的PC12细胞也是半悬浮细胞。N2aSK-N-SH293 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm每代贴附生长细胞的生长过程 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形，细胞附着于底物上，游离期 结束。10分钟一4小时贴壁期。 潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞株潜伏期一般为624小时。

3、 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 37 CO2: 5% 3 无污染 4 无毒 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm培养前准备培养前准备 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat d

4、er Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 常用玻璃器皿清洗 浸泡24小时（自来水加洗洁精） 刷洗（洗洁精） 玻璃器械（90烤箱） 酸泡（12小时以上） 自来水洗20遍,蒸馏水洗3遍、90烘干 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 常用培养板清洗 浸泡24小时（自来水加洗洁精） 超声清洗仪 超声30min 用纱布，棉签等清洗 37度烘箱烘干 酸泡（12小时以上） 自来水洗20遍,蒸馏水洗3遍、37烘干 PD Dr. D. Brockmann, Dekan

5、at der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 完全培养基的组成 基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 血 清 血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 无须灭活 PD Dr.

6、D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 抗菌素的使用 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm无菌操作的要求1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面；2.靠近酒精灯火焰操作；3.器皿使用前必须过火灭菌；4.继续使

7、用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸；6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 贴壁生长细胞传代方法 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm直接传代法 用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 （如N2a, 293） PD Dr. D. Brockmann,

8、 Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm胰酶消化法 常用的消化液有0.125的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法： 1 吸光培养瓶中的培养液2 加入D-hanks液洗一次 3 加入1-2 ml 0.125的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 37度消化5-10 min（显微镜下动态监测）4 吸去胰蛋白酶液，加入完全培养基5 用吸管吸取瓶内培养基，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。6 吸取1/101/30细胞悬液，接种于新的培养瓶内 7 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内8 将培养瓶放入培养箱中培养 PD Dr. D. Br

9、ockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm 细胞的冻存和复苏细胞的冻存和复苏 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt,

10、Universitt Ulm 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比: 1. 减少人力、经费消耗; 2. 减少污染而造成传代中断和种子 丢失; 3. 减少细胞生物学特性变化。冻存的必要性 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm冻存和复苏的原则：慢冻速融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应

11、快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低冰点，延缓冻结过程；提高胞膜对水的通透性，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少胞内冰晶形成，从而减少冰晶对细胞的损伤。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm细胞冻存方法

12、1 观察细胞生长情形；2 冷冻前一日更换培养基; 配制冻存液：完全培养基9份DMSO 1份配成10的DMSO冻存液, 充分混匀.(避免因临时配制产热而伤害细胞)； 也可以直接从公司购买 （GIBCO，冻存液 ）3 取对数生长期细胞，弃去旧的培养基, 加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 补充：新鲜培养基吹散细胞，1000g*5min,离心收集细胞，然后用适量的1.5vml冻存液重悬。3 加入1-2ml细胞于冻存管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期及代数。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Faku

13、ltt, Universitt Ulm慢冻程序标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中简易程序： 4 冰箱, 30min; -20 冰箱, 30min-1h;（2h） -80 冰箱, 1h； 液氮 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm细胞复苏方法 （方法1）（l） 在超净工作台中, 取10-15 ml 培养基置于培养瓶中, 每个培养瓶中放置一带吸球的玻璃吸管；（2）从液氮或-80冰箱中取出冷冻管，迅

14、速投入4045 水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化；（3）在无菌条件下取出细胞, 接种于含10-15 ml培养基的培养瓶中；（4）置37温箱静置培养。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm细胞复苏方法 （方法2）（l） 在超净工作台中, 取5-10ml 完全培养基置于培养瓶中, 每个培养瓶中放置一带吸球的玻璃吸管.（2）从液氮或-80冰箱中取出冷冻管，迅速投入4045 水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化.（3）4 ，1000转离心5分钟，超净台迅速去除冻存液并用完全培养基重悬

15、。（4）接种于含5-10 ml完全培养基的培养瓶中。（5）置37温箱静置培养。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm复苏后期注意事项(1) 置37温箱静置培养12小时，更换培养基，加入5-10ml新的培养基；(2) 继续培养3天，更换培养基，加入5-10 ml新的培养基；(3) 继续培养3天，观察细胞生长情况. 在适当的时候将细胞吹散并进行传代。细胞经过冻存和复苏不可避免会有部分死亡, 死亡细胞释放的毒性物质以及冻存液中的DMSO对细胞的复苏是极其不利的. 因此，要及时将不贴壁、飘浮在培养液

16、上（已死亡）的细胞倒掉，补以新的培养基，给细胞创造一个无毒无害的适合生存的环境。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm原代海马神经元培养 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm常规的试剂配制常规的试剂配制 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm常规必备 1、种植培养基：高糖DMEM/F12+

17、10%FBS 2、维持培养基：neurobasal+2%B27+L-glutamate （0.5 mM） 3、Poly-D-Lysine（PDL）：Sigma，避光 4、D-hanks 5、Trypsin Solution 0.125% PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm器械 大剪刀 记数板 眼科镊 青霉瓶 眼科剪 筛 网 平 皿 烧 杯 离心管 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm准备

18、工作 1、高压器械，超纯水，D-hanks液；准备好种植及维持培养基； 2、处理玻片，用PDL工作液包被灭菌后的玻片，室温放置30min，然后用灭菌好的超纯水洗三次，D-hanks液清洗一次，超净台吹干，照紫外30min。 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm大鼠海马的解剖大鼠海马的解剖 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der

19、 Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm1. 取材 取脑：选取E18 SD胎鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，置于D-hanks液 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm2、分离 以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，用眼科剪充分剪碎组织 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Mediz

20、inischen Fakultt, Universitt Ulm3、消化加入胰蛋白酶，终浓度为0.125%的，37 培养箱内化10-15 min左右，每间隔5分钟摇1次 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm4、过滤 加入等体积种植培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞数分钟，至组织快成细胞悬液即停止吹打，动作要轻柔，用200目网筛过滤，收集细胞悬液 PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm6、离心1000r、5min is OK！ PD Dr. D. Brockmann, Dekanat der Medizinischen Fakultt, Universitt Ulm6、接种 1000 rpm离心5 min，倾去上清，用完全培养基重悬细胞，轻轻吹打，细胞计数板计数，根据实