脑缺血再灌注时bcl-2蛋白的表达及药物干预作用的研究

1、脑缺血再灌注时bcl-2蛋白的表达及药物干预作用的研究摘要：目的：探讨bcl-2在脑缺血再灌注时脑损伤过程中的作用，以及川芎嗪和尼莫通对其影响。方法：采用免疫组化法检测大鼠脑缺血再灌注不同时间内bcl-2蛋白表达的水平，以及川芎嗪和尼莫通干预后bcl-2蛋白表达的变化。 结果：(1)脑缺血再灌注时缺血侧皮层和基底节区均有bcl-2阳性表达，其阳性表达率随再灌注时间不同而不同，于缺血2h再灌注3h时阳性表达达高峰。（2）川芎嗪、尼莫通干预组脑缺血再灌注时皮层和基底节区bcl-2的表达均明显增高。结论：bcl-2在脑缺血再灌注过程中发挥重要作用，川芎嗪和尼莫通可明显上调bcl-2的表达。关键词：脑

2、缺血再灌注 bcl-2 药物干预A study on protein expression of bcl-2 in rats after focal cerebral ischemia followed by reperfusion and the effects of pharmaceutic interventionsWang ChunxiaBao ShiyaoZhang Zhilinet al（Department of Neurology Second Affliliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266042）Abs

3、tract：Objective：To investigate the effect of bcl-2 protein on brain injury in reperfusion after cerebral ischemia and the effects of Ligustrazini(LZ) and Nimodipine(NM)intervention.Methods：Changes in protein expression of bcl-2 after focal cerebral ischemia followed by reperfusion were detected by i

4、mmunohistochemical method and the effects of Ligustrazini and Nimodipine intervention were observed. Results： Expression of bcl-2 positive cells was found in ischemic cortex and basal ganglia area atfer cerebral ischemia followed by reperfusion,and the level of positive expression varied to the dura

5、tion of reperfusion,and reached the peak level at 3h reperfusion after 2h cerebral ischemia.In LZ group and NM group,the protein expression of bcl-2 increased significantly after ischemia/reperfusion both in the ischemic cortex and in the ischemic basal ganglia.Conclusions： Bcl-2 play great role in

6、cerebral ischemia followed by reperfusion in rats, LZ and NM can significantly regulate up the protein expression of bcl-2 and inhibit the occurance of apopotosis.Key words：Cerebral ischemia/Reperfusionbcl-2Pharmaceutic interventions 近年研究表明，缺血性脑组织损伤有两种形式：缺血性坏死（necrosis）和凋亡（apoptosis）。脑缺血时伴有多种凋亡相关基因和

7、蛋白的表达，提示细胞凋亡机制参与了缺血性脑损伤的形成。本文探讨了大鼠脑缺血再灌注损伤过程中bcl-2蛋白表达的变化，以及川芎嗪和尼莫通对bcl-2蛋白表达的影响。1材料和方法1.1动物模型制备及分组：健康雄性SD大鼠，体重250300g,共76只。采用大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。动物分组：随机将大鼠分成以下三组：（1）脑梗死体积组（n=8）。（2）未用药组：假手术组（n=4）；缺血2h再灌注1h组（n=8），再灌注3h（n=8），再灌注6h（n=8），再灌注12h组（n=8）。（3）药物干预组：川芎嗪组又分缺血2h再灌注3h组（n=8）和再灌注6h组（n=8），尼莫通组又分

8、缺血2h再灌注3h组（n=8）和再灌注6h组（n=8）。1.2脑梗死体积的测量法：将大鼠缺血6小时后断头取脑，冠状切片，将切片立即置于2%红四氮唑（TTC）磷酸缓冲液中避光、37恒温孵育30min。采用病理像分析仪（北京航空航天大学像中心制造）测量脑梗死面积，根据梯形法则计算脑梗死体积。1.3bcl-2的免疫组化检测法：将实验大鼠于缺血再灌注后，断头取脑，自额极至枕叶分为A、B、C、D、E共5等分，取C脑片置冰冻切片机内行冠状切片，片厚15m。免疫组化染色采用SP法。bcl-2免疫组化试剂盒购于北京中山生物试剂有限公司，抗体浓度为1：50。结果判断：采用病理象分析仪，观察并计数阳性细胞。显微镜

9、下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。每张切片中采集10个具有代表性的高倍视野，其中大脑皮层5个，基底节区5个，每个视野中细胞总数不少于100个，尔后计算阳性率。阳性率=阳性细胞数/（阳性细胞数+阴性细胞数）100%。1.4 统计学处理：应用STATA软件包进行统计分析。各组阳性率以百分数（%）表示，组间比较采用X2检验。2结果2.1脑梗死体积：经TTC染色后，实验大鼠于右侧额、顶叶皮层及尾壳核区出现边界清晰、范围较恒定的苍白梗死灶，经计算机像分析仪测量脑梗死面积，根据梯形法则算得脑梗死体积为198.7928.36mm3。表1 脑缺血再灌注不同时间内bcl-2的表达组别 阴性细胞数 阳性细胞数

10、阳性率（%） X2值 假手术组 3 080 0 0 缺血2h 再灌注1h 5 534 903 14.03 再灌注3h 3 980 1 088 21.47* 109.671* 再灌注6h 5 604 1 381 19.77* 78.233* 再灌注12h 5 719 920 13.86 0.079 注：X2值是与缺血2h再灌注1h组相比所得，*P0.01表2 脑缺血2h再灌注不同时间未用药组与用药组bcl-2的表达组别 阴性细胞数 阳性细胞数 阳性率（%） X2值 再灌注3h 未用药组 3 980 1 088 21.47 川芎嗪组 3 015 1 645 35.30* 229.939* 尼莫通组

11、 3 393 1 721 33.65* 189.175* 再灌注6h 未用药组 5 604 1 381 19.77 川芎嗪组 3 181 1 513 32.33* 233.900* 尼莫通组 2 756 1 574 36.35* 380.820* 注：X2值是与未用药组相比所得，*P0.012.2脑缺血再灌注时bcl-2表达的变化 假手术组及缺血再灌注组非缺血侧大脑半球均未见bcl-2阳性表达。缺血再灌注组在缺血侧皮层和基底节区均有bcl-2阳性表达，但其阳性表达率随再灌注时间不同而不同。结果见表12.3川芎嗪、尼莫通对bcl-2表达的影响与未用药组相比，缺血2h再灌注3h和再灌注6h时，川芎

12、嗪组与尼莫通组皮层和基底节区bcl-2的表达均有显著性增高。结果见表2：3讨论bcl-2基因为原癌基因。目前已发现5个bcl-2基因家族（bcl-2、bcl-x、bax、mcl-1和A1），其中bcl-2可抑制细胞程序性死亡（PCD）。bcl-2对细胞的影响可被称为“bax的促死亡相对物”所调节，bax-bax同源二聚体可促进细胞死亡，而bcl-2-bax异源二聚体则抑制细胞死亡，细胞的存亡依赖这些分子的相对浓度。本实验结果表明：脑缺血再灌注时在缺血侧皮层和基底节区均有bcl-2阳性表达，并随再灌注时间不同，其阳性表达率亦不同，并于再灌注3h阳性表达达高峰，再灌注12h阳性表达明显下降，bcl

13、-2的这种变化可能是神经细胞自我保护机制之一，可防止或减少脑缺血再灌注时细胞凋亡的发生。bcl-2在脑缺血再灌注过程中的作用机理可能有：（1）抑制Ca2+的释放。bcl-2是一种跨膜蛋白，其主要位于核膜上，核内外膜之间由内质网管腔相连，后者是细胞内Ca2+的主要贮存场所，而Ca2+在细胞凋亡过程中起重要作用。应用转基因方法发现bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca2+，故推测bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与细胞内质网中Ca2+有关1。（2）bcl-2通过阻止促凋亡基因信号传递，或阻止这些诱导基因产物而发挥抗细胞凋亡作用。研究表明bcl-2蛋白可抑制P53诱导的细胞凋亡等2。（3）bcl-2可

14、通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用，bcl-2具有抗氧化剂作用，它可抑制超氧化物的产生和作用，从而抑制细胞凋亡的发生3。本实验结果发现，川芎嗪和尼莫通均可明显上调缺血再灌注时bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，推测其机理可能为：（1）川芎嗪和尼莫通通过抑制Ca2+超载、减少自由基的产生等与bcl-2发生协同作用，从而阻止细胞凋亡的发生；（2）川芎嗪和尼莫通亦可能通过抑制促凋亡基因如c-fos、P53、c-jun等作用，而非直接作用于bcl-2发挥抗凋亡作用；（3）有实验显示，bcl-2可抑制神经元线粒体的渗透传导能力4。川芎嗪和尼莫通能与Ca2+通道受体可逆地结合，调节Ca2+的细胞内流量，保持神经元

15、线粒体的完整性。故川芎嗪和尼莫通与bcl-2可能均作用于神经元线粒体上，保护脑组织，减轻脑缺血再灌注时的脑损伤，提高神经元对缺血缺氧的耐受性。但其确切的作用机理仍有待于进一步的研究阐明。尼莫通因具有脂溶性高、易穿过血脑屏障、对线粒体Na+-Ca2+交换器有显著抑制作用等优点5，其抑制Ca2+内流的作用较川芎嗪强，因此推测尼莫通上调bcl-2表达的程度较川芎嗪明显可能与此有关。总之，bcl-2在脑缺血再灌注过程中发挥重要作用，而川芎嗪和尼莫通均可明显上调脑缺血再灌注时bcl-2的表达，抑制细胞凋亡的发生。本研究为临床应用川芎嗪和尼莫通治疗缺血性脑血管病提供充分的理论依据。作者单位：王春霞（青岛医

16、学院第二附属医院神经科266042）包仕尧（苏州医学院附二院神经科）张志琳（苏州医学院附二院神经科） 刘春风（苏州医学院附二院神经科）参考文献：1Krajewski S,Tanaka S,Takayama S,et al.Investigation of the subcellular distribution of bcl-2 oncoprotein. Cancer Res,1993,53:47012Li Y,Chopp M,Zhang Zg, et l. P53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke,1994,25:8493Jacobson MD.Rective oxygen speaes and programmed cell death. TIBS,1996,21:834Ma