糖尿病大鼠视网膜缺氧诱导因子(1)

1、    糖尿病大鼠视网膜缺氧诱导因子(1)    】 目的：探讨链脲佐菌素（STZ）糖尿病大鼠视网膜组织中缺氧诱导因子1（HIF1）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达规律. 方法：Wister大鼠60只，分为实验组(T组,45只）和对照组(C组,15只）. 实验组建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，并随机分为T1，T3，T5三个组，每组15只，分别代表糖尿病模型1， 3， 5 mo;对照组同样随机分为C1，C3，C5三个组，每组5只. 分别采用免疫组织化学法检测视网膜VEGF表达、免疫印迹法检测视网膜HIF1表达，结

2、果以平均吸光度值进行定量比较. 结果：糖尿病模型成功率86.6793.33%. VEGF检测结果：对照组各组间差别无统计学意义（P0.05）；T1与对照组间差别无统计学意义（P0.05），但T3，T5与对照组间差别均有统计学意义（t值分别为6.12，8.67，P<0.01），并且T3，T5两组间差别也有统计学意义（t=3.45，P<0.05）. HIF1检测结果：对照组各组间差别无统计学意义（P0.05）；T1，T3，T5分别与对照组相比，其差异均有统计学意义（t值分别为4.35，5.01，5.34，P<0.01），但实验组各组间差异无统计学意义（P0.05）. 结论：STZ

3、糖尿病大鼠视网膜内可观察到VEGF和HIF1的高表达，后者早于前者，提示在视网膜病变时HIF1的表达可能是VEGF表达的始动因素.【关键词】 STZ大鼠；糖尿病视网膜病变；缺氧诱导因子；血管内皮细胞生长因子0引言糖尿病目前已成为严重危害公共健康的问题，可引起全身多数器官并发症，而其中微血管并发症之一的视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），也日益成为致盲的主原因. 有关DR的病理生理过程已有大量实验研究，并已发现血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是引起DR血管渗漏、新生血管形成的主细胞因素之一1. 然而， 在

4、糖尿病患者眼部微环境下引起VEGF等细胞因子大量分泌的确切机制还不甚明了. 本实验我们从缺氧诱导因子1（hypoxiainducible factor1， HIF1）这一途径， 探讨糖尿病条件下视网膜VEGF表达增加的机制.1材料和方法1.1材料选取封闭群雄性Wistar大鼠60只，体质量190210 g，适应性饲养3 d，分为实验组（T组，45只）和对照组（C组，15只）. 将T组再随机分为T1，T3，T5三个组，每组15只，分别代表糖尿病模型1，3，5 mo；C组同样随机分为C1，C3，C5三个组，每组5只. 所有动物均在相同条件下饲养. 链脲佐菌素（streptoztocin, STZ)

5、，美国Sigma公司产品；一抗为兔抗鼠VEGF mAb（1100），二抗为生物素化羊抗兔IgG，所有抗体和SABC试剂盒，DAB显色剂均购于美国DAKO公司;一抗（1200兔抗HIF1多克隆抗体)，美国Sigma公司.1.2方法1.2.1糖尿病大鼠模型的建立2取STZ溶于0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，配置成浓度1.25%的溶液，按60 mg/kg对T组大鼠行一次性腹腔内注射，C组大鼠腹腔注射等量柠檬酸缓冲液. 药物注射后2448 h检测血糖和尿糖，血糖浓度高于16.5 mmol/L，尿糖达，尿量、饮水明显增多即为模型建立成功；低于上述标准则为造模失败. 实验组T1，T3，T

6、5及对照组C1，C3，C5分别在造模成功后1，3，5 mo处死，取标本进行下列实验.1.2.2免疫组织化学法（SABC）检测视网膜VEGF的表达实验动物经10 g/L戊巴比妥钠（40 mL/kg）腹腔麻醉，用0.1 mo/L含有40 g/L多聚甲醛的PBS液灌流固定，摘除眼球，石蜡包埋后行16 m连续切片，SABC法行免疫组织化学染色检查，其中对照组一抗以PBS液代替，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行. 阳性结果为胞浆内出现棕褐色颗粒. 染色结果用LuzexF实时图像分析系统进行分析，计算平均A值.1.2.3免疫印迹法（Western Blot）检测   

7、0;        【关键词】STZ大鼠；,糖尿病视网膜病变；,缺氧诱导因子；,血管内皮细胞生长因子Expressions of hypoxiainducible         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。视网膜HIF1的表达实验动物同前麻醉，固定后，摘除眼球去除眼前段成眼杯，仔

8、细分离出视网膜组织，剪碎后置于裂解液中机械匀浆，4，17 000 g离心30 min，取上清液以紫外分光光度计定量，等量蛋白上样进行75 g/L SDSPAGE电泳，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上. 37孵育2 h，洗膜，加11000的辣根过氧化物酶标记的二抗，37孵育1 h，洗膜后加入化学发光液反应1 min，曝光显影后冲洗胶片. 显色结果同样用图像分析系统计算平均A值.统计学处理： 用SPSS 11.0统计软件对各实验数据进行分析处理，结果以x±s表示，采用Fisher确切概率计算法、多组间比较方差分析、组间比较t检验等进行差异显著性分析.2结果2.1大鼠糖尿病模型实验组腹腔注射ST

9、Z后成功复制出糖尿病动物模型：T1组15例，成功14例，失败1例；T3组15例，成功13例，失败2例；T5组15例，成功14例，失败1例. 通过Fisher确切概率计算法（PT1:3，PT3:5，PT1:5的概率分别为0.388，0.388，0.517），可见三组之间的造模成功率无显著差异，故可以认为三组的造模成功率基本一致.    2.2各组不同时段视网膜VEGF表达免疫组化染色结果显示，对照组各组视网膜VEGF可见弱表达，一般在内核层可见少数阳性染色，但不随时间变化而改变（图1）. 各组不同时段之间的VEGF A值并无显著性差异（表1）. 实验组在成

10、模后1 mo， VEGF表达较对照组仅略有增强，其A值与对照组相比并无显著性差异，但随着时间的延长，实验组VEGF表达明显增强，特别是T5组，视网膜内核层、节细胞层及血管壁等均可见阳性染色（图2）.表1各组不同时段VEGF及HIF1 A值（略）2.3各组不同时段视网膜HIF1表达通过免疫印迹检测，对照组各组HIF1有弱表达，其A值维持一基线状态，不同时段差别无统计学意义（表1）. 实验组各组HIF1表达均明显增强，与对照组相比有显著性差异，但各组A值并不随时间改变而发生显著变化，组间差别无统计学意义（表1）. 图3显示成模5 mo后实验组与对照组HIF1免疫印迹结果（M为标记物，上下两个条带分

11、别代表225 bp和162 bp）.3讨论STZ大鼠是目前比较公认的经典糖尿病DR模型，基本可以模拟人背景型DR的大致病理改变2. 本实验成功复制出STZ大鼠模型，成功率在90%左右，保证了后续实验结果的真实可信.糖尿病DR是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，其中VEGF起着举足轻重的作用. VEGF导致新生血管的原因，一方面是直接促进微血管内皮细胞增生，另一方面是VEGF使微血管内皮细胞通透性增强，大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许并支持新生血管和基底细胞向内生长3. 临床研究也发现，在合并活动性新生血管病变的眼如糖尿病性DR、视网膜中央静脉阻塞、早产儿DR

12、等的眼内液中VEGF表达显著增高，而在无新生血管对照眼的眼内液中则表达较低. 眼内直接给予VEGF更能诱发出典型的新生血管病变4. 本实验在成模后3 mo和5 mo大鼠视网膜上观察到了明显的VEGF高表达，并且有随时间延长表达逐渐增多的趋势，与对照组相比有显著性差异，而1 mo组则没有明显增多，提示VEGF是在缺氧发生后，某些始动因素的刺激下表达增多，符合糖尿病DR的发展规律.为明确DR时引起VEGF表达增多的原因，本实验还观察了缺氧诱导因子1（HIF1）的变化. HIF1是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白，它作为转录因子与靶基因结合，促进其转录，从而使机体产生一系列缺氧适应反应. HIF1是一种

13、异源二聚体，由HIF1和HIF1两个蛋白质亚基组成， HIF1亚基主起结构性的作用，在细胞内稳定表达；HIF1则是主的功能亚基，受缺氧信号的调控，并且只有在缺氧状态下才能稳定表达. HIF1的活性主由HIF1的蛋白质水平和活性决定5. 能被HIF1诱导的基因启动子或增强子内有一个小于100 bp的DNA序列，称为缺氧反应元件（hypoxia response element, HRE），介导细胞对缺氧的反应，HRE由HIF1结合位点和两侧的功能序列构成. 缺氧条件下HIF1和HIF1蛋白由胞浆进入核内，发生二聚形成稳定的HIF1，活化的HIF1与靶基因HRE中的HIF1结合位点结合，形成转录起

14、始复合物，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应6. 而VEGF正属于上述靶基因之列，其转录起始点上游具有HRE结构，缺氧状态下可被HIF1激活而表达增多7. 本研究发现，造模成功后1 mo，即可见到HIF1的表达增多，与对照组有显著性差异，提示此时视网膜已经发生缺氧性改变. 但是其后一段时间内，虽然HIF1都保持高表达，但是不同时段之间却并无显著性差异，即HIF1似乎并无随时间延长不断增多的趋势，这可能与HIF1的半衰期短有关. Huang等8发现：由于HIF1经泛素蛋白酶途径不断发生水解，使其在常氧下的半衰期小于1 min，因此它很难在细胞内大量聚集，只能在受到缺氧信号刺激后不断产生，如果

15、缺氧状态持续存在，则它的表达就持续增高，不过不能像VEGF那样表现出随时间不断增高的趋势.由于实验中对VEGF的检测采用的是免疫组化的方法，受敏感性的限制，在成模后1 mo时，尚不能发现VEGF蛋白质表达的变化，按照实验中HIF1的变化规律，推测此时VEGF表达也应有一定程度的增多，这有待今后加以探索.【参考文献】1Shen WY, Lai CM, Graham CE,et al. Longterm global retinal microvascular changes in a transgenic vascular endothelial growth factor mouse mode

16、lJ. Diabetologia, 2006, 49(7): 1690-1701.2宋鄂, 董宇, 石博, 等. STZ糖尿病大鼠视网膜病变模型的评价J.眼科研究, 2004, 24(2):124-127.3Ferrara N, DavisSmyth T. The biology of vascular endothelial growth factorJ. Endocr Rev, 1997,18(1):4-25.4Suganthalakshmi B, Anand R, Kim R, et al. Association of VEGF and eNOS gene polymorphisms

17、in type 2 diabetic retinopathyJ. Mol Vis, 2006,11(12):336-341.5Arjamaa O, Nikinmaa M. Oxygendependent diseases in the retina: Role of hypoxiainducible factorsJ. Exp Eye Res, 2006,83(3):473-483.6Chen C, Pore N. Regulation of glut 1 mRNA by hypoxiainducible factor: Interaction between Hras and hypoxia

18、J. J Biol Chem, 2001,276(12):9519-9525.            【关键词】STZ大鼠；,糖尿病视网膜病变；,缺氧诱导因子；,血管内皮细胞生长因子Expressions of hypoxiainducible         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。7Michel G, Minet E, Mottet D, et al. Sitedirected mutagenesis studies of the hypoxiainducible factor1 alpha D