血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL60细胞作用的研究

1、血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL?60细胞作用的研究    作者：孙玲，王一浩，刘少君，王芳，马鸿雁，孙慧 席雨人    【摘要】 本研究探讨VEGF ASODN抑制白血病细胞内源性VEGF mRNA的表达作用及其与白血病细胞凋亡的关系。用阳离子聚合物介导硫代修饰VEGF ODN转染体外培养白血病细胞系HL?60细胞后，采用MTT法检测细胞增殖抑制率，RT?PCR检测VEGF mRNA表达，以细胞形态学，凝胶电泳，流式细胞术观察细胞凋亡。结果显示： 反义组与错义组、空白对照组相比，在细胞增殖抑制率和V

2、EGF mRNA的表达水平方面均具有显著性差异(p<0.05)；错义组与空白对照组相比无统计学差异（p>0.05）。反义组可见细胞皱缩，颗粒增多，核固缩并出现细胞碎片，而错义组、空白对照组细胞轮廓清楚，胞体透亮，生长旺盛；反义组有凋亡梯形带，错义组和空白对照组仅见1条DNA条带；反义组细胞凋亡率达19.46，与错义组、空白对照组相比具有显著性差异（p<0.05）；错义组与空白对照组相比，无统计学差异（p>0.05）。 VEGF ASODN联合VP16的细胞凋亡率与等同条件单用VP16组相比有统计学差异（p<0.05）； 且凋亡率具有时间和剂量依赖关系。结论： VE

3、GF ASODN能抑制白血病细胞内源性VEGF mRNA的表达，诱导白血病细胞的凋亡，抑制增殖，且增强VP16对白血病细胞诱导凋亡作用，两者联合效应具有相加作用。    【关键词】 白血病    Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Antisense Oligonucleotide on Human Leukemic Cell Line HL?60    Abstract    Th

4、is study was aimed to investigate expression of vascular endothelial growth factor mRNA (VEGF mRNA) and its relationship with leukemic cell apoptosis after VEGF antisense oligonucleotide(VEGF ASODN )transferred into HL?60 cells. The phosphorothiate VEGF ODN was transferred into HL?60 cells in vitro

5、by using cation poly mediated method, the inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, expression of VEGF mRNA was measured by RT?PCR, cell apoptosis was detected by cell morphology observation, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometer (FCM). The results showed that difference

6、 of    the inhibitory rate of cell proliferation and the relative expression of VEGF mRNA    between ASODN group and MSODN or control groups under the same condition（p<0.05）    was statistic significant, but no significant difference （p&

7、gt;0.05） was found between MSODN and control. The number of clusters of cells in ASODN group decreased; the morphology features of apoptotic cells involved cell shrinking,more granulation in cytoplasm, nuclear contracting and many fragments of cells. In MSODN and control groups, however, cells were

8、plump and clear, and grow healthly. The result of electrophoresis revealed DNA ladder in ASODN group, while only one band of DNA in control groups.The rate of cell apoptosis was 19.46 in ASODN group with a significant difference as compared with MSODN groups and control（p<0.05）.The rate of HL?60

9、cell apoptosis in combination of VEGF ASODN with VP16 was significantly higher than that in VP16 alone （p<0.05） and showed time? and dose? dependence. It is concluded that VEGF ASODN can down?regulate expression of VEGF mRNA of HL?60 cells, induces the apoptosis , inhibits the proliferation of HL

10、?60 cells and enhances VP16?induced apoptosis in HL?60 cells, the VEGF ASODN in combination with VP16 shows additive effect.    Key words    VEGF；leukemia；antisense oligonucleotide； HL?60 cell; apoptosis    J Exp Hematol 2007; 15(4):849-853

11、    血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一种多功能的糖基蛋白，在白血病患者体内呈高表达。体外白血病细胞株的培养证实， 白血病细胞不仅分泌 VEGF, 而且表达特异性 VEGF受体, VEGF 可通过旁分泌参与白血病细胞的增殖及浸润，而且与白血病细胞表面特异性受体结合促进白血病细胞生长及降低对放化疗的敏感性。对其机制目前尚存有争议，有学者认为VEGF可直接促进白血病细胞增殖，而有学者认为VEGF具有抗凋亡作用。本研究针对上述争议通过反义技术直接封闭内源性VEGF表达观察白血病细胞生长情况

12、，探讨VEGF和白血病细胞的关系。    研究对象    白血病细胞系HL?60由郑州大学医学院组织胚胎教研室提供。    试剂和设备    RPMI 1640培养液(Gibco公司产品)，胎牛血清(TBD公司产品)，TRIzoL Reagent(美国Invitrogen公司产品)，梭华SofastTM 基因转染试剂盒(厦门太阳马生物工程有限公司产品)，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis K

13、it(加拿大MBI 公司产品)，PCR试剂盒(上海Sangon 生物工程技术服务公司产品)，Annexin V?FITC 试剂盒(晶美生物工程有限公司产品)，VP16(山东齐鲁制药有限公司产品)，CO2孵育箱(德国Heraeus公司产品)，Eagle eyeTM凝胶扫描分析系统(美国Stratagene公司产品)，DNA热循环扩增仪PE480(美国PE公司产品)，流式细胞仪EPILS_XL(美国Beckman?Coulter公司产品)。    硫代磷酸寡脱氧核苷酸（thiophospate oligonucleotide，ODN）和引物的合成 

14、   VEGF ODN按参考文献1由上海Sangon生物工程技术服务公司391型DNA合成仪(PE公司)合成。VEGF ASODN:5 T GGCTTGAAGATCTCGAT 3，VEGF MSODN:5 TACGTATGGTGTACGATC 3，VEGF引物扩增产物545 bp；VEGF上游引物:5 T CGGGCCTCCGAAACCATGA 3，VEGF下游引物:5 CCTGGAGAGAGATCTGGTTC 3；?actin内参照扩增产物为300 bp，上游引物：5?TCCTGTGGCATC CACGAAACT?3，下游引物：5?GAAGCATTTGCG GT

15、GGACGAT?3。    细胞培养    采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，将HL?60细胞置于37、5% CO2、饱和湿度的恒温孵育箱中培养2。    VEGF ODN对HL?60细胞增殖及VEGF mRNA表达的影响    将VEGF ASODN、MSODN各配成5，10，20 mol/L 3 种不同浓度。严格按照梭华?SofastTM 基因转染试剂盒说明书具体步骤操作。    

16、;增殖抑制率的MTT法检测    按MTT法常规操作，检测增殖抑制率，增殖抑制率计算公式如下：    增殖抑制率（1实验组值/空白对照组值）×100%    VEGF mRNA表达的RT?PCR检测    实验分为3组： ASODN组、MSODN组、空白对照组。空白对照组加入相同量不含血清的RPMI 1640培养液，以?actin为内对照，用RT?PCR方法检测转染后各组HL?60细胞VEGF mRNA的表达。采用6孔培养板，

17、按照上述步骤将20 mol/L VEGF ASODN转染HL?60细胞48小时后，参照TRIzoL提取试剂盒说明书抽提RNA,提取的6 l RNA样品在含6%甲醛的15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，在电压8 V/cm下电泳30分钟后，置于凝胶扫描成像系统下观测结果并照相检测RNA的完整性。用分光光度法作单链RNA的定量，参照试剂盒说明书cDNA制备进行操作，完成cDNA合成后进行PCR扩增。取8 l加有载样缓冲液的扩增产物加至含有溴化乙锭的2琼脂糖凝胶中，在电压8 V/cm下电泳60分钟后，置凝胶扫描成像系统下观察结果并照相。将各样本的PCR光密度值除以各内对照?actin的PCR光密度值，以

18、其比值作为各目的mRNA的表达量。检测重复3次。    VEGF ODN对HL?60细胞凋亡的影响    VEGF ODN转染HL?60细胞48小时后，于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。收获各组细胞，提取DNA置琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察并凝胶扫描照相。按FCM Annexin V?FITC 试剂盒说明书操作上机检测细胞凋亡率。    VEGF ODN与VP16联合对HL?60细胞作用    实验分组如下：VEGF ASODN VP?

19、16(5 g/L)组, VP?16(5 g/L) 组； VEGF ASODN VP?16(10 g/L) 组, VP?16(10 g/L) 组； VEGF ASODN VP?16(20 g/L) 组, VP?16(20 g/L) 组；空白对照组。取浓度均为2×105/L细胞100 l接种于96孔板，按上述步骤转染VEGF DON，同时加入不同浓度的VP?16。每组设3个平行孔，重复2次。VEGF ASODN与VP16作用后用流式细胞仪测定细胞凋亡。    统计学处理    结果用SPSS 11.0统计软件

20、处理,检验标准以p<0.05为差异有显著性。    结    果    VEGF ODN对HL?60细胞生长的抑制作用    MTT检测结果显示，相同条件的反义组细胞增殖抑制率明显高于错义组（p<0.05），且在相同时间点抑制率随VEGF ASODN浓度而递增，相同浓度的VEGF ASODN对细胞增殖抑制率随时间而递增， 20 mol/L和48小时分别是本试验VEGF ASODN的最适作用浓度和时间（表1）。 &#

21、160;  琼脂糖凝胶电泳图能清楚见28S rRNA、18S rRNA及5S rRNA或5.8S rRNA 3条清晰条带，提示抽提的总RNA完整性好（图1）。所提RNA经紫外分光光度仪分析，其OD280/OD260比值均在1.8-2.0之间，提示无蛋白质或酚等杂质污染，RNA的浓度为0.3-0.5 g/l。    VEGF ODN 对HL?60细胞VEGF mRNA表达的影响    反义组VEGF mRNA相对表达率与错义组、空白对照相比均有显著性差异（p<0.05），错义组与空白对照相比

22、无显著性差异（p>0.05）(表2、图2)。    细胞形态学的改变    反义组细胞集落减少，胞体缩小，胞膜皱缩，胞浆中颗粒增多，染色质凝集，核固缩并出现细胞碎片；而错义组、空白对照组细胞均呈半贴壁生长，细胞轮廓清晰，胞体透亮，生长旺盛（图3）。    细胞DNA的电泳变化    琼脂糖凝胶电泳显示：错义组和空白对照组均仅在靠近加样孔处见1条完整的DNA带，而反义组见到多条明显向远端延伸的典型凋亡梯形带（图4）。Figure 3

23、. Morphology of HL?60 cells transferred by VEGF CDN (incubated for 48 hours, ×200).    细胞凋亡的水平    FCM检测显示，反义组细胞凋亡率达19.46，与错义组、空白对照组的凋亡率3.27、2.61相比具有显著性差异（p<0.05）（表3）。    讨    论    研究表明，VEGF在白血

24、病患者血清及体外白血病细胞株的培养液和胞浆中均有不同程度地异常高表达；VEGF不仅通过促进骨髓血管新生改变骨髓微环境促使白血病细胞的增殖浸润3，而且还能直接通过自分泌途径促进白血病细胞增殖，加速白血病发展，影响白血病治疗效果和预后4-6。内源性VEGF促进白血病细胞自身生长增殖，其机理是VEGF如癌基因那样直接促进白血病细胞有丝分裂，还是抗凋亡作用，目前研究者对此认识尚有分歧。假设VEGF是通过抗凋亡机制促进白血病细胞增殖，那么用反义技术封闭VEGF基因表达后就能促进白血病细胞凋亡。我们的研究结果证实了这一假设，利用阳离子聚合物VEGF ASODN作用于白血病细胞后能显著抑制白血病细胞增殖，通

25、过MTT检测其抑制率达67.29，且抑制率呈时间和剂量依赖关系。转染20 mol/L VEGF ASODN作用HL?60细胞48小时后细胞凋亡率达19.46，反义组凋亡率与错义组、空白对照组相比有显著统计学意义（p<0.05），而错义和空白对照组间无统计学差异（p>0.05）。VEGF与白血病细胞凋亡密切相关，虽然不清楚VEGF是否具有直接促白血病细胞有分裂作用，但证实VEGF在很大程度上是通过抗凋亡而促进白血病细胞增殖。    实验结果提示VEGF有抗凋亡作用，其抗凋亡机制又是什么呢？日本学者Katoh等7用台盼蓝染色计数法研究表明,VEG

26、F能够抑制VP16和ADM引起的白血病细胞凋亡。应用VEGF刺激白血病细胞株CMK86之后,用Northern blot检测Bcl?2家族的表达水平,发现其中只有抗凋亡基因mcl?1的mRNA水平增高。Kuramoto等8利用载体转染技术,得到mcl?1表达增强的白血病细胞株U937,经VP16处理,mcl?1能够降低由于化疗作用激发的caspase 3活性,提高细胞转染的存活力。还有学者研究发现, VEGF刺激CMK86细胞和人类造血祖细胞后,一种锌指蛋白ZK7的mRNA表达,该蛋白可能与VEGF及其受体的信号转导途径有关。用转染了ZK7的细胞观测其对电离辐射和VP16的敏感性，发现较亲代细

27、胞降低，表明ZK7蛋白可能作为造血细胞的凋亡抑制因子发挥作用，VEGF能够诱导白血病细胞稳定而过量表达ZK7，说明VEGF可能通过多种机制抑制白血病细胞凋亡。其他学者致力此项研究得出许多理论实验结果9，10。此外，本试验研究结果还提示阳离子聚合物介导VEGF ASODN转染白血病细胞后其细胞增殖抑制率明显高于既往文献报道11，12，这可能与本试验应用阳离子聚合物介导VEGF ASODN转染HL?60细胞，且采用硫代磷酸修饰反义寡核苷酸增加稳定性有关13。试验操作提示，阳离子聚合物介导的硫代修饰VEGF ASODN 转染HL?60细胞时整个转染操作不改变培养液的血清浓度， HL?60细胞均在恒定

28、血清浓度中培养，阳离子聚合物可提高VEGF ASODN转染效率；在取得等同转染效果时降低了VEGF ASODN的最低有效浓度，这为阳离子聚合物介导的硫代修饰VEGF ASODN逐步应用于临床提供了理论基础，阳离子聚合物介导的硫代修饰VEGF ASODN将可能成为治疗白血病的一种新药物。    VP16是一种DNA拓扑异构酶抑制剂，能够诱导白血病细胞凋亡。VEGF ASODN联合VP16作用HL?60细胞其效果具有相加作用， VEGF ASODN可增加HL?60细胞对VP16的敏感性，减少药物最低有效浓度，降低其毒副作用，提高疗效。VP16联合VEGF A

29、SODN可能成为白血病治疗的一种新方案，这将为白血病治疗提供新的途径。 【参考文献】 1费嘉,张洹.血管内皮生长因子基因反义核酸设计及其对HL?60细胞生长的影响.暨南大学学报，2003；24：1-62司徒镇强, 吴军正主编. 细胞培养.西安.世界图书出版公司.2003: 128-1293de?Bont ES, Rosati S, Jacobs S， et al. Increased bone marrow vascularization in patients with acute myeloid leukaemia: a possible role for vascular endothe

30、lial growth factor. Br J Haematol， 2001；113:296-3044Santos SC, Dias S. Internal and external autocrine VEGF/KDR loops regulate survival of subsets of acute leukemia through distinct signaling pathways. Blood， 2004；103: 3883-38895Lu QR, Park JK, Noll E, et al. Oligodendrocyte lineage genes (OLIG) as molecular markers for human glial brain tumors. Proc Natl Acad Sci USA，2001;98:10851-108566张伟平，陈些群，陈永清等.bFGF和VEGF在急性白血病中的表达及对HL?60细胞生长的影响.中国实验血液学杂志，2005；13：91-947Katoh O, Takah