EB病毒裂解期DNA复制的研究概况

1、华夏医学第 13 卷第 1 期2000 年 2 月V o l. 13 N o. 1F eb. 2000A C TAM ED IC IN A ES IN ICAEB 病毒裂解期 DN A复制的研究概况曾越(法国里昂第一大学免疫病毒分子生物学实验室)Ep ste in2B a r r 病毒 (EB 病毒) 属人类疱疹病毒, 是传染性单核细胞增多症, B u rk it t 淋巴瘤和鼻咽癌的主要诱发因素, 其 中 鼻咽癌在我国南方, 特别是广东和广西等省 ( 区) 发病率很高 (10 30100 000) , 占癌症发病率首位。 此外, EB 病毒与 T淋巴细胞瘤, 口腔腺体肿瘤, 胸腺瘤, 器官移

2、植后淋巴瘤等肿 瘤的病因关系在国际上也有报道1, 2 。EB 病毒进入宿主细胞后, 处于潜伏期, 病毒基因组持续 存在于细胞内, 只有少量病毒蛋白表达。超早期蛋白的出现标志着病毒周期进入裂解期, 其中包括早期, DN A 复制期和晚 期。 早期病毒蛋白主要用于 DN A 复制, 而晚期蛋白是一些壳蛋白和膜蛋白, 用以包装复制完成的 DN A , 形成病毒颗粒。一个完整的病毒周期如图 1 所示。病毒在裂解期的DN A 复制是 它在细胞里繁殖的重要阶段, 因此对这个过程的研究是了解病毒作用机理和抵抗疾病的重要一环。2EB 病毒裂解期 DN A 复制的参与蛋白1992 年, F ixm an 等6

3、研究了 EB 病毒基因组不同片段对含有 O r ily t 质粒复制的影响, 实验证明有 6 种蛋白对病毒的DN A 复制是必不可少的, 它们分别是: ZEBRA 蛋白, DN A 多 聚酶及其辅助蛋白 EA 2D , 解链酶和引物酶的复合体, 还有主要 DN A 结合蛋白 P 135。ZEBRA 蛋白: 这是一个超早期蛋白, 由 245 个氨基酸组 成。它不仅是一个转录活化因子7 , 可以激活一些早期蛋白的转录, 而且可以识别 O r ily t, 对病毒 DN A 复制起着重要作用。 转录因子在 DN A 复制过程中发挥作用的例子屡见不鲜, 如A P 18 , V P 169 和 Ga14

4、10, 它们的作用机理可以大致分为:一方面通过与 DN A 特殊序列相结合而改变基因组复杂的空间结构, 使其他 DN A 复制蛋白容易进入复制区; 另外转录因 子可以通过与复制蛋白的结合, 把它们装置在复制起始位点上, 共同完成 DN A 复制的使命。解链酶与引物酶的复合物: 它由 3 个蛋白结合而成, 其中 包括解链酶, 引物合成酶和它们的结合蛋白6 。目前国际上对这个蛋白复合物的研究有限, 但对单纯疱疹病毒 (H S 病毒) 的 同源复合蛋白了解较多, 由此可以推测其功 能: 使 两 条 母 链DN A 分离, 合成 RN A 引物, 供 DN A 多聚酶合成 DN A 。 第三 个结合蛋

5、白的功能可能是与另外两个酶结合, 形成复合物, 并11促进这两个酶的活性。 Gao 等的实验证明只有三个蛋白同时存在, 这个复合物才会出现在细胞核中, 缺 少 其 中 任 何 一 个, 另外两个蛋白都只分布在细胞浆里, 不能参与 DN A 复制。图 1EB 病毒在宿主细胞里的繁殖周期1EB 病毒裂解期 DN A 复制的起始位点在 1988 年, H amm e r schm id t 和 Sugden 3 通过对带有 EB病毒基因组不同片段的质粒复制能力的分析, 确定病毒基因组 上两段相同的序列为裂解期 DN A 复制起始位点, 它们被命名 为 O r ily t。 这两个 O r ily t

6、 位点之中任何一个都可以使 DN A 进 行复制, 至于病毒在进化过程中为什么会保留两段功能相同的 O r ily t, 有可能它们在不同的宿主细胞内, 或在细胞周期的不同 阶段所起的作用不同: 也有可能是它们可以交替使用, 为确保 病 毒 在 被 选 择 的 过 程 中 占 据 优 势。O r ily t 的 中 心 部 分 约 1,4k b , 由两个带有重复序列的基本区和一段辅助区构成。基本区的碱基空间序列呈螺旋状, 其中一个碱基的改变可以 使整个带有 O r ily t 的质粒失去 DN A 复制功能4 , 而辅助区 虽非缺之不可, 但它的存在可以大大提高质粒的复制。 此外,O r i

7、ly t 上有七个 ZR E 位点, 这些位点可以被病毒超早期蛋白ZEBRA 识别, 其中四个位点是 DN A 复制所必不可少的5 。DN A 多 聚 酶 及 其 辅 助 蛋 白 EA 2D : DN A多 聚 酶 为110k d。 它与带有 RN A 引物的 DN A 的亲和力大于单链 DN A或 RN A 12 , 由此可以推断 DN A 多聚酶可以从 RN A 引物起 始, 对母链 DN A 模板进行复制, 按照碱基互补的原则, 合成子 链 DN A 。 另外 DN A 多聚酶有反向 (3到 5) 外切 DN A 的特性13, 可以令其切除在合成 DN A 过程中末端出现错误的碱基, 保

8、证复制的正确率。EA 2D 蛋白是 DN A 多聚酶的结合蛋白, 约 50k d。细胞体外实验证明它可以大量提高 DN A 多聚酶 的 两 种 特 性: 从 5 到 3 合 成 DN A , 和 从 3 到 5 外 切DN A 14, 15 。 EA 2D 的作用机理可能在于增强 DN A 多聚酶与 DN A 模板相结合的稳定性, 防止 DN A 多聚酶脱离 DN A , 因 而终止子链 DN A 的合成。主要 DN A 结合蛋白 P 135: 它由 1 128 个氨基酸组成。 这是一个 DN A 结合蛋白, 尤其与单链 DN A 亲和力较高16 。 它 在 DN A 复制过程中所起的作用至关

9、重要: 在带有部分缺失的EB 病毒基因组的 R a ji 细胞株里, 病毒在活化剂的诱导下进入裂解期的早期, 但不能进行 DN A 复制。 而当其中一个缺失的 基因, 即 P 135 的编码基因被转染进入 R a ji 细胞后, 可以观察 到病毒 DN A 的复制, 晚期蛋白的表达, 以及少量病毒颗粒的形成, 这充分证明了 P 135 蛋白在病毒裂解期过程中是必不可少的17 。目前对 P 135 蛋白在 DN A 复制过程中的作用大致有 三点推测: 1) 由于它与单链 DN A 的亲和力较高, 可以与 DN A 复制过程中分开的两条母链 DN A 相结合, 防止由于两条母链 之间重新互补结合,

10、 而影响子链 DN A 的合成; 2) P 135 可以与酸, 与模板中腺苷互补; 另外有可能是胞苷酸 脱 氨 形 成 尿 苷酸, 引起突变26 。U N G 可以因此减少新合成的 DN A 中由于 插入尿苷酸引起的变异。DN A 降解酶有内切酶及 5到 3外 切酶的活性27 , 分子量约为 50k d 左右。 它可以降解宿主细胞 DN A , 提供合成病毒 DN A 所需的脱氧核苷酸28 。另外由于它可以和 DN A 复制所需的 DN A 多聚酶29EA 2D 蛋白29,和P 135 蛋白18 相结合, 因此有可能直接参与 DN A 复制, 但具体功能不详。 最后, 有人认为它有与单纯疱疹病

11、毒的 DN A 降解 酶类似的功能, 使合成的 DN A 中间产物成熟化, 成为可以装入壳蛋白的基因组30 。病毒 DN A 降解酶和 DN A 多聚酶相互结合18, 而细胞体外实验 证 明 P 135 可 以 抑 制 DN A 降 解 酶 的 活 性19 , 但 可 以 促 进DN A 多聚酶对 DN A 的合成16 。 由此可以推测 P 135 通过和 这些 DN A 复制所需要的蛋白酶相结合, 从而调节它们的功3EB 病毒在裂解期 DN A 复制的模式目前国际上认为 EB 病毒在裂解期 DN A 复制模式与单能; 3) Zeng 等18通过免疫沉淀的方法已证明,P 135 在裂解纯疱疹病

12、毒相类似, 表现为两个阶段, 先是 式, 然后为滚环式。 式 DN A 复制时, 病毒 DN A 游离体保持环状, 首先从一 个起点出发, 两条 DN A 母链相分离, 并分别被作为模板, 由DN A 多聚酶合成与其互补的子链 DN A 。 复制叉向两个相反的方向前进, 呈 状。 最后形成两个相连的环, 分离后由连接 酶将缺口修补形成完整的环。 滚环式的 DN A 复制是在病毒 DN A 游离体的一条环上的特殊位点断裂, 形成一个 3羟基末 端, 由此不断加入新的核苷酸与另一条 DN A 链互补; 而断裂 的另一端则不断与对应的 DN A 链分离, 成为一个越来越长的 线 状 末 端, 而 被

13、 当 作 模 板, 由 DN A 多 聚 酶 合 成 与 其 互 补 的 DN A 链。由于 DN A 多聚酶仅能沿 5到 3的方向催化子链的 合成, 因此子链是不连续的, 它在 DN A 连接酶的催化下, 连成 完整的子链。 在电镜下可以观察到一个环状 DN A , 拖着一条 长度相当于几个病毒基因组的长长的尾巴, 这条长链而后被切成一个基因组的长度。对 EB 病毒在裂解期 DN A 复制产物 的分析表明, 初期有大量 DN A 游离体形成, 然后就出现相连 接的大分子量分子31, 32 。 这一复制形式如图 3 所示。 对带有 O r ily t 的质粒复制过程的观察也同样证明双阶段 DN

14、 A 复制 的学说33 。期的早期, DN A 复制以前, 即与 DN A 多聚酶和 EA 2D 蛋白相结合。而另一蛋白 ZEBRA 则识别并结合 DN A 复制起始位点O r ily t。然后 P 135 通过与 ZEBRA 蛋白相结合, 把其他蛋白带 到 O r ily t 位点上, 使这些蛋白行使其 功 能, 进 行 DN A 合 成。 P 135 蛋白在 DN A 复制过程中的这一功能可以综合如图 2 所示。图 2 P 135 在 DN A 复制过程的功能模式图除此以外, 病毒的另外一些蛋白酶参与核酸代谢及新生 DN A的成熟化。 虽然它们并不是 DN A 复制过程中所必不可少的,但当

15、细胞里这些蛋白酶产量少时, 脱氧核苷酸含量少, 不能合 成大量的 DN A 。 此时病毒自身合成这些蛋白酶, 提高细胞内脱氧核苷酸的量, 从而有利于合成大量的病毒 DN A 。核苷酸脱氧酶将核苷酸转化为脱氧核苷酸20 。EB 病毒 编码的这个蛋白有两个亚基, 分别为 85k d 和 34k d, 根据对氨基酸序列的分析, 以及对单纯疱疹病毒同源蛋白的研究, 小亚基具有酶的活性21 , 而大亚基可以结合底物脱氧核苷酸22 。 胸苷激酶可以使胸苷磷酸化23 。它大约有 67k d。酶活性位于 蛋白 C 端。与细胞胸苷激酶所不同的是, 它对底物的选择特异 性 差, 可以使核苷酸衍生物的类似物, 如

16、A raT ( 阿糖胸苷) 和A CV (无环鸟苷) 磷酸化。而这些形成的磷酸物却可以抑制 EB 病毒DN A 多聚酶的活性, 从而阻止病毒DN A 的合成, 因此可 以用于特异性抗病毒的化学疗法。 尿苷磷酸降解酶可以使尿苷三磷酸转化为尿苷一磷酸, 即胸苷酸的前身24 。由于此酶提 高 了 胸 苷 酸 的 浓 度, 而 降 低 了 尿 苷 酸 的 含 量, 可 以 减 少 在 DN A 合成过程中因加入尿苷酸而产生的错误。尿苷脱糖酶可 以除去插入 DN A 中的尿苷酸25 。 两种现象可以导致尿苷酸 出现在 DN A 中: 一是由于 DN A 多聚酶错把尿苷酸当成胸苷图 3滚环式 DN A 复

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43、1015仿真内窥镜成像技术及临床应用C T曹林德廖锦元唐勇(广西区第二人民医院广西桂林市541002)C T 仿真内窥镜 (C T V ir tua l endo scop e 简称: C TV E ) 技术是以螺旋 C T 资料为资源, 采用特殊的计算机软件对空腔器 官内表面具有相同像素值的部分进行立体重建, 以模拟光学纤维内窥镜效果的方式来显示其内腔的结构, 并附加伪彩着 色, 以获得人体腔道内三维或动态三维解剖学图像的一种方法, 1994 年 V in ing 1 等首先报道了 C TV E 成像技术在结肠及 支气管病变诊断中的应用后, 此项技术的应用范围逐渐拓宽。近年来国内的一些医疗机构已开展了这方面的工作, 并取得 了一定的经验。咽动作; 气管支气管扫描时患者屏气。鼻腔检查时为了消除可逆的鼻腔充血和粘液分泌, 可在 C T 扫描前使用滴鼻剂14 。2 C TV E 技术临床应用现状2. 1 支气管 C TV E提供