生物化学--酶化学ppt课件

1、 酶酶 化化 学学 (Chemistry of (Chemistry of Enzyme)Enzyme)本章重点及难点本章重点及难点重点：了解酶作为生物催化剂的特点、国重点：了解酶作为生物催化剂的特点、国际命名；了解酶催化作用机理际命名；了解酶催化作用机理 ；掌握酶促；掌握酶促反响动力学中米氏方程及反响动力学中米氏方程及KmKm的意义、运用，的意义、运用，掌握影响酶促反响动力学的要素及与影响掌握影响酶促反响动力学的要素及与影响酶催化高效性的要素之间的区别。掌握别酶催化高效性的要素之间的区别。掌握别构酶的特点及核酶、同工酶、诱导酶等的构酶的特点及核酶、同工酶、诱导酶等的概念。概念。难点：酶催化作

2、用机理难点：酶催化作用机理 、各要素对酶促反、各要素对酶促反响速度的影响及酶促反响动力学的运用。响速度的影响及酶促反响动力学的运用。第一节第一节 通通 论论一、酶学研讨历史一、酶学研讨历史n公元前两千多年，我国已有酿酒记载。公元前两千多年，我国已有酿酒记载。n一百余年前，一百余年前，Pasteur以为发酵是酵母细胞生命活动的以为发酵是酵母细胞生命活动的结果。结果。n1877年，年，Kuhne初次提出初次提出Enzyme一词。一词。n1897年，年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。现了发酵。n1926年，年，Sumner初次从刀豆中提纯出脲酶结

3、晶。初次从刀豆中提纯出脲酶结晶。n1982年，年，Cech初次发现初次发现RNA也具有酶的催化活性，也具有酶的催化活性，提出核酶提出核酶(ribozyme)的概念。的概念。n1995年，年，Jack W. Szostak研讨室首先报道了具有研讨室首先报道了具有D N A 衔 接 酶 活 性衔 接 酶 活 性 D N A 片 段 ， 称 为 脱 氧 核 酶片 段 ， 称 为 脱 氧 核 酶(deoxyribozyme)。 二、什么是酶？二、什么是酶？ 酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分化作用的一类具有活

4、性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。 三、酶与普通催化剂的共性及特性三、酶与普通催化剂的共性及特性 1、共性1不发生质、量的变化，但能 改动反响速度2不改动反响的平衡点，但能 缩短反响时。3可降低反响活化能4只能催化热力学允许的反响 2、个性1极高的催化效率2高度专注性3易失活4酶活性可调控5催化作用与构造有关 酶专注性类酶专注性类型型1. 构造专注性构造专注性 酶对所催化的分子底物，酶对所催化的分子底物，Substrate化学构化学构造的特殊要求和选择造的特殊要求和选择 类别：绝对专注性和相对专注性类别：绝对专注性和相对专注性2.

5、 立体异构专注性立体异构专注性 酶除了对底物分子的化学构造有要求外，对其酶除了对底物分子的化学构造有要求外，对其立体异构也有一定的要求立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专注性和几何异构专注性类别：旋光异构专注性和几何异构专注性四、酶作用专注性的假说四、酶作用专注性的假说(1)、锁钥学说模板学说、锁钥学说模板学说 (2)、多位点亲和实际、多位点亲和实际(3)、诱导契合学说、诱导契合学说(3)、诱导契合学说、诱导契合学说五、酶的命名和分类五、酶的命名和分类1. 命名：习惯命名；系统命名命名：习惯命名；系统命名2. 国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 *国际生物化学会酶学委员会国际生物化学

6、会酶学委员会Enzyme Commsion将酶分成六大类：将酶分成六大类：1.氧化复原酶类，氧化复原酶类，2.转转移酶类，移酶类，3.水解酶类，水解酶类，4.裂解酶类，裂解酶类，5.异构酶类，异构酶类，6.合合成酶类成酶类 * 每一种酶有一个编号每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号 第二节第二节 酶的分子构造与功能酶的分子构造与功能酶酶简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 结合酶酶蛋白酶蛋白辅助因子辅助因子简单蛋白质简单蛋白质结合蛋白质结合蛋白质apoenzym

7、eapoenzymecofacter)cofacter)辅酶辅酶coenzyme)辅基辅基(prosthetic group)全酶全酶(holoenzyme= 酶蛋白酶蛋白 + 辅助辅助因子因子一、酶的组成一、酶的组成* *各部分成分在催化反响中的作用各部分成分在催化反响中的作用q酶蛋白决议反响的专注性酶蛋白决议反响的专注性q辅助因子决议反响的种类与性质辅助因子决议反响的种类与性质 金属酶金属酶(metalloenzyme) 金属离子与酶结合严密，提取过程中不易丧失。金属离子与酶结合严密，提取过程中不易丧失。 金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的

8、活性所必需，但与酶的结合不金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚严密。甚严密。 辅助因子分类辅助因子分类按其与酶蛋白结合的严密程度按其与酶蛋白结合的严密程度 辅酶辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。法除去。 辅基辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合严密，不能用透析或超滤的与酶蛋白结合严密，不能用透析或超滤的方法除去。方法除去。或称活性部位，酶分子中直接和底物结或称活性部位，酶分子中直接和底物结合并起催化反响的空间局限部位。合并起催化反响的空间局限部位。1. 酶的活性中心结合部位和催化部酶的活性中心结

9、合部位和催化部位位二、酶分子的构造特征二、酶分子的构造特征催化部位 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位，催化部位决议酶所催化反响的性质。 活性中心的特点活性中心的特点n 活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只需几个aa残基组成。n 酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级构造中构成的，酶的活n 性中心的aa残基在一级构造能够相距很远，但在空间构造上非常靠n 近。n 酶与底物的结合是活性部分与底物的外形发生诱导锲合的过程。n 酶的活性部位位于酶分子外表的一个裂痕内，底物分子就结合到这n 个裂痕内，裂痕内含较多疏水基团，有利于结合催化。n 酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合经

10、过次级键。AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心活性中心重要基团活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195 2. 2. 必需基团必需基团指酶表现催化活性不可短少的基团，指在活指酶表现催化活性不可短少的基团，指在活性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。 底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 三、与酶的高效率有关的主要要素战略三、与酶的高效率有关的主要要素战略 1、 临近与定向效应临近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形诱导契合与底物扭

11、曲变形 3、 共价催化共价催化 4、 酸碱催化酸碱催化 5、微环境影响、微环境影响酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团胰凝乳蛋白酶反响的详细机制胰凝乳蛋白酶反响的详细机制1结合底物结合底物His57 质子供体质子供体构成共价构成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物胰凝乳蛋白酶反响的详细机制胰凝乳蛋白酶反响的详细机制2羰基产物释放羰基产物释放四面体中间物四面体中间物的瓦解的瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放第三节第三节酶促反响的动力学酶促反响的动力学本节需求处理的问题n底物浓度与酶促反响速度的影响n酶浓度对酶促反响速度的影响

12、npH对酶促反响速度的影响n温度对酶促反响速度的影响n激活剂对酶促反响速度的影响n抑制剂对酶促反响速度的影响一、底物浓度对反响速度的影响一、底物浓度对反响速度的影响一、曲线的根本含义一、曲线的根本含义n单底物、单产物反响单底物、单产物反响n酶促反响速度普通在规定的反响条件下，酶促反响速度普通在规定的反响条件下，用单位时间内底物的耗费量和产物的生成用单位时间内底物的耗费量和产物的生成量来表示量来表示n反响速度取其初速度，即底物的耗费量很反响速度取其初速度，即底物的耗费量很小普通在小普通在5以内时的反响速度以内时的反响速度n底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度v在其他要素不变的情况下，底物

13、浓度对反响速在其他要素不变的情况下，底物浓度对反响速 v 度的影响呈矩形双曲线关系。度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反响速度与底物浓度成正比；反反响速度与底物浓度成正比；反响为一级反响。响为一级反响。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反响速度不再成正比例加速；反响反响速度不再成正比例加速；反响为混合级反响。为混合级反响。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反响速度不再添加，达最大速度；反响速度不再添加，达最大速度；反响为零级反响。反响为零级反响。二米氏方程式二米氏方程式中间产物中间产物E + S k1k2k3ESE + P 快速平衡实际快速平衡实际 1913

14、 1913年年 Michaelis Michaelis和和Meuten Meuten 提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定定ESES分解成产物的逆反响可忽略不计，因此在分解成产物的逆反响可忽略不计，因此在“快速平衡实际的根底上快速平衡实际的根底上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反响速率之间的定量关系，推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反响速率之间的定量关系，称为米氏方程。称为米氏方程。 稳态平衡实际稳态平衡实际 1925 1925年年BriggsBriggs和和HaldaneHaldane提出，反响进展一段时间后，提出，反响进展一段时间后，E

15、SES浓度添加到一浓度添加到一定值时，定值时，ESES也在不断分解，只需当也在不断分解，只需当ESES的生成速度与分解速度相等时，的生成速度与分解速度相等时，ESES的的浓度才坚持不变，并对米化方程进展了修正，但为留念仍称米氏方程。浓度才坚持不变，并对米化方程进展了修正，但为留念仍称米氏方程。S：底物浓度：底物浓度 V ：反响速度：反响速度 Vmax：最大反响速度：最大反响速度m：米氏常数：米氏常数V=Vmax SKm + S米米氏氏方方程程的的推推导导 121kkkESSESSEt令：令：Kmkkk121将将4代入代入3，那么：，那么： SKSVvmmax1kES 1kES2kEP ESEt

16、 SESES生成速度：生成速度： SESEkvt11，ES分解速度：分解速度：ESkESkv212即：即： ESkESkSESEkt211那么那么： SSESESKmtE(1)经整理得：经整理得： SKSEmtES由于酶促反响速度由由于酶促反响速度由ES决议，即决议，即ESkv22kvES，所以，所以(2)将将2代入代入1得：得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)当酶反响体系处于稳态时：当酶反响体系处于稳态时：21vv 当当Et=ES时，时，mVv tmEkV2(4)所以所以 KmS * Km值等于酶促反响速度为最大反响速度一半值等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度，单位

17、是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSKm的意义的意义 Km值值 Km等于酶促反响速度为最大反响速度一半时等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度。的底物浓度。 意义：意义：a) Km是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；b) Km可表示酶对底物的亲和力；可表示酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的Km值。值。 Vmax的意义的意义定义：定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反响速度，是酶完全被底物饱和时的反响速度， 与酶浓度成正比。与酶浓度成正比。 意义：意义：Vmax=K3 E 假设酶的总浓度知，可从假设酶的总

18、浓度知，可从Vmax计算计算 酶酶 的转换数，即动力学常数的转换数，即动力学常数K3。-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km3.3.米氏常数米氏常数KmKm的测定的测定二、酶浓度对酶促反响速度的影响二、酶浓度对酶促反响速度的影响 当当SE，酶可被底物饱和的情况下，酶可被底物饱和的情况下，反响速度与酶浓度成正比关系式为：反响速度与酶浓度成正比关系式为：V = K3 E三、温度对酶促反响速度的影响三、温度对酶促反响速度的影响(1)(1)、一方面是温度升高、一方面是温度升高, ,酶促酶促 反响速度加

19、快；反响速度加快；(2)(2)、另一方面、另一方面, ,温度升高温度升高, ,酶的酶的 高级构造将发生变化或变性，高级构造将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；导致酶活性降低甚至丧失； (3)(3)、因此大多数酶都有一个最、因此大多数酶都有一个最 适温度。适温度。 在最适温度条件在最适温度条件 下下, ,酶促反响速度最大。酶促反响速度最大。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)四、四、pH对酶促反响速度的影响对酶促反响速度的影响五、激活剂对酶作用的影响五、激活剂对酶作用的影响 金属离子：K+、Na+

20、、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 复原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA定义：凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。定义：凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。类别：类别：六、抑制剂对酶反响的影响六、抑制剂对酶反响的影响酶的抑制造用酶的抑制造用 有些物质能与酶分子上某些有些物质能与酶分子上某些必需基团结合作用必需基团结合作用),),使酶的活性中使酶的活性中心的化学性质发生改动，导致酶活力心的化学性质发生改动，导致酶活力下降或丧失。下降或丧失。失活作用失活作用 凡可使酶变性而引起酶活力丧失凡可

21、使酶变性而引起酶活力丧失的作用。的作用。 抑制剂抑制剂 可以引起酶的抑制造用的化合物。可以引起酶的抑制造用的化合物。抑制剂的特点抑制剂的特点 a. a.在化学构造上与被抑制的底物在化学构造上与被抑制的底物分子或底物的过渡形状类似。分子或底物的过渡形状类似。 b. b.可以与酶的活性中心以非共价可以与酶的活性中心以非共价或共价的方式构成比较稳定的复合体或共价的方式构成比较稳定的复合体或结合物。或结合物。两者的区别：两者的区别： n抑制剂对酶的抑制造用有选择性，一种抑制剂只能引抑制剂对酶的抑制造用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶的活性丧失活降低，而蛋白量变性起一种酶或一类酶的活性丧失活降

22、低，而蛋白量变性剂可使一切的酶变性失活。剂可使一切的酶变性失活。n在抑制剂与酶的结合而导致的抑制造用中，抑制剂普在抑制剂与酶的结合而导致的抑制造用中，抑制剂普通都具有以下特点：一方面在化学构造上与被抑制酶通都具有以下特点：一方面在化学构造上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态类似构造上。另一方的底物分子或底物的过渡态类似构造上。另一方面可以与酶的活性中心以非共价键或共价的方式构成面可以与酶的活性中心以非共价键或共价的方式构成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂那么作用方式比较稳定的复合体或结合物，而变性剂那么作用方式较多。较多。抑制造用的类型抑制造用的类型 非专注性不可逆抑制 不可逆抑制造用 专注

23、性不可逆抑制 抑制造用 竞争性抑制 可逆抑制造用 非竞争性抑制 反竞争性抑制p (1)不可逆抑制造用p 抑制剂与酶反响中心的活性基团以共价方式结合，引起酶的永久性失活。非专注性不可逆抑制剂非专注性不可逆抑制剂 抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因此引起酶失活。基团中包含了必需基团，因此引起酶失活。类型：类型：专注性不可逆抑制剂专注性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专注性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专注性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。性丧失。 实

24、例：有机磷杀虫剂实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX2可逆性抑制造用抑制剂通常以非共价键与酶或酶抑制剂通常以非共价键与酶或酶- -底物复合物可逆底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。透析、超滤等方法除去。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 竞争性可逆抑制竞争性可逆抑制某些抑制剂的化学构造与底物类似，因此能与底物竟争与酶某些抑制剂的化学构造与底物类似，因此能与底物竟争与酶活性中心结合。活性中心结合。竟争性抑制通常可以经过增大底物浓度，即提高底物

25、的竞争竟争性抑制通常可以经过增大底物浓度，即提高底物的竞争才干来消除。才干来消除。动力学：动力学：VmaxVmax不变；不变；KmKm值添加，酶与底物的亲和力降低。值添加，酶与底物的亲和力降低。磺胺类药物的设计磺胺类药物的设计 竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线 磺胺类药物的抑菌机制磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物非竞争性可逆抑制非竞争性可逆抑制定义：定义： 酶可同时与底物及抑制

26、剂结合，引起酶分子构酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。剂。动力学：动力学：VmaxVmax减小，减小，KmKm不变，酶与底物亲和力不变。不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，金属离子，EDTAEDTA等等 非竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线n定义：抑制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引 、n 起酶活性下降。n动力学：km减少，酶对底物亲和力添加，最大反响n 速度减少，也无法经过改动底物浓度而改 n 变反响

27、抑制剂的影响。n n举例：多底物反响中反竞争性抑制造用反竞争性抑制造用反竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线一、酶分别纯化的普通原那么与蛋白质类似 1、资料的预处置； 2、破碎细胞； 3、蛋白质的粗提与杂质分开； 4、将蛋白质沉淀出来等电点、盐析法、有机溶剂法； 5、粗制品纯化凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法。七、酶的分别纯化和活力测定七、酶的分别纯化和活力测定1. 酶活力酶活力enzyme activity, 也称酶活性也称酶活性 二、酶的活力与测定二、酶的活力与测定 酶催化一定化学反响的才干，用在一定条件下酶所催化酶催化一定化学反响的才干，用在一定条件下酶所催化反响的反响速度来表示。反响的

28、反响速度来表示。 酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位unit, Uunit, U，就是表示酶量多少的单位。其表示方法与一，就是表示酶量多少的单位。其表示方法与一切的测定方法有关。切的测定方法有关。 习惯上沿用的单位如习惯上沿用的单位如 :乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的添加量表示，也乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的添加量表示，也可用可用340nm光吸收的添加量来表示。光吸收的添加量来表示。 2. 酶活力单位的表示方法酶活力单位的表示方法 国际单位国际单位(IU)：196

29、1年年 在最适条件下，每分钟催化在最适条件下，每分钟催化1mol底物底物的减少或产物的消费所需的酶量为一个国际的减少或产物的消费所需的酶量为一个国际单位。单位。 催量单位催量单位(katal)：1972年年 指在最适条件下，每秒钟使指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所底物转化为产物所需的酶量。需的酶量。 1Kat6107IU ，可以以纳，可以以纳Kat、微、微Kat来进来进展换算。展换算。3测定酶活力时应留意几点测定酶活力时应留意几点 1应测反响的初速度应测反响的初速度2酶的反响速度普通用单位时间酶的反响速度普通用单位时间 内产物的添加量来表示。内产物的添加量来表示。 3测酶活力时应

30、使反响温度、测酶活力时应使反响温度、pH、离子、离子 强度和底物浓度等要素坚持恒定。强度和底物浓度等要素坚持恒定。 4测定酶反响速度时，应使测定酶反响速度时，应使SE。 产产物物浓浓度度P(t)4. 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 1分光光度法分光光度法spectrophotometry 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。分光吸收不同。 如氧化复原酶类。如氧化复原酶类。简便、迅速、准确。简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学研讨。一个样品可多次测定，有利于动力学研讨。 可检测到可检测到10-9mol/L程度的变化。程度的变

31、化。 优点：优点：习惯上沿用的单位如习惯上沿用的单位如 :乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的添加量表示，也乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的添加量表示，也可用可用340nm光吸收的添加量来表示。光吸收的添加量来表示。 2荧光法荧光法fluorometry 该法要求酶反响的底物或产物有荧光变化。该法要求酶反响的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。的样品。 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、残基以及一些辅酶、辅基，

32、如辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。等都能发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + NAD+ 乙醛乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶3酶偶联分析法酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一同反响。酶系统在一同反响。 2P 2E1P 1E S P1无光吸收或荧光变化，偶联后无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有有光吸收或荧光变化。光吸收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖 + ATP 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸 + ADP 己糖激酶

33、己糖激酶葡糖葡糖-6-磷酸磷酸 + NADP 葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸 + NADPH + H+ G-6-P脱氢酶脱氢酶5. 酶的比活力酶的比活力specific activity，也称比活性，也称比活性 比活力：指每比活力：指每mgmg蛋白质所具有的酶活力，普通用蛋白质所具有的酶活力，普通用U/mgU/mg蛋白蛋白 质来表示。质来表示。 比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml酶含多少个活力单位来表示。酶含多少个活力单位来表示。 比活力总活力单位数比活力总活力单位数蛋白质总毫克数蛋白质总毫克数 活力单位数活力单位数mg蛋白质蛋白质 (杂蛋白杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白包括酶

34、蛋白及含非酶蛋白 比活力是酶纯度衡量的重要目的之一比活力是酶纯度衡量的重要目的之一终点法终止法：测定完成一定量反响所需求的时间，普通 测产物的生成量比较好。动力学方法延续法：测定一定时间内所起的化学变化量， 灵敏度较高。6、测定酶活力的普通方法 1. 纯化倍数 2. 比活力 3. 回收率 三、如何衡量纯化的酶的质量三、如何衡量纯化的酶的质量 第第 四四 节节 酶的调理酶的调理一一 、酶原与酶原的激活、酶原与酶原的激活 酶原激活的机理酶原激活的机理酶酶 原原分子构象发生改动分子构象发生改动构成或暴显露酶的活性中心构成或暴显露酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水

35、解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝甘甘异异缬缬组组丝丝 酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义防止细胞产生的酶对细胞进展本身消化，防止细胞产生的酶对细胞进展本身消化，并使酶在特定的部位和环境中发扬作用，保证并使酶在特定的部位和环境中发扬作用，保证体内代谢正常进展。体内代谢正常进展。有的酶原可以视为酶的储存方式。在需求有的酶原可以视为酶的储存方式。在需求时，酶原适时地转变成有活性的酶，发扬其催时，酶原适时地转变成有活性的酶，发扬其催化作用。化作用。二、变构酶二、变构酶 变构酶别构酶变构酶别构酶 有些酶可以与

36、某些化合物称为变构剂发生非共价结合，引起酶有些酶可以与某些化合物称为变构剂发生非共价结合，引起酶分子构象的改动，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为分子构象的改动，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为。 构造特点构造特点 活性中心结合部位和催化部位和变构中心特殊的调控部活性中心结合部位和催化部位和变构中心特殊的调控部位。位。 留意：变构中心不是酶活性中心的组成部分。留意：变构中心不是酶活性中心的组成部分。酶的别构变构效应表示图酶的别构变构效应表示图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心中心调理物：也称效应物，普通指的是酶的底物或底物类似物调理物：也称效应物，普通指的是酶的底物或底物类

37、似物 或代谢的终产物。或代谢的终产物。别构效应：别构效应： 调理物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用遭调理物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用遭到影响，从而调理酶的反响速度代谢过程，这种效应称为别构效应。到影响，从而调理酶的反响速度代谢过程，这种效应称为别构效应。 正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。 负效应物负效应物: 指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。 1 1常为多个

38、亚基构成的寡聚体；常为多个亚基构成的寡聚体；2 2具有别构效应；具有别构效应；3 3动力学曲线不符合米曼方程双曲线；动力学曲线不符合米曼方程双曲线；4 4酶分子上含两个中心或部位：活性中心酶分子上含两个中心或部位：活性中心 活性部位和别构中心别构部位。活性部位和别构中心别构部位。1963年，年，Monod等初次提出别构酶的概等初次提出别构酶的概念。他以为别构酶应具备以下特征：念。他以为别构酶应具备以下特征： 同促效应：配体一样。当一个效应物与酶结合后， 影响另一一样的效应物与酶的结合。 异促效应：配体不同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一不同效应物与酶另一部分结合。别构效应的种类别构效应的种

39、类1 1、根据配体性质分、根据配体性质分2、协同效应 一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应 物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，有利于后续底物分子或调理 物分子的结合。负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，不利于后续底物分子或调理 物分子的结合。别构酶调理的两种模型别构酶调理的两种模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化序变模型序变模型KNW：1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer 提出。提出。 齐变模型齐变模型MWCMWC： 19651965年由年由MonodMonod、WymanWyman和和ChangeuxChangeux提出。提出。 S SSSS