SPE固相萃取技术的原理,类型,方法和应用ppt课件

1、固相萃取固相萃取SPESPE技术技术翟宇君奥妙科技zhaiyjaumigrp客服: 0531-8856-3956固相萃取技术SPE 一、 概述 二、 SPE根本原理 三、 SPE法的优点 四、 SPE安装 五、 SPE的类型 六、 SPE方法的建立 七、 SPE的运用一、概述 所谓萃取法 ,就是从样品中提取组分 ,传统的方法是液液萃取法 ( LLE) ,即用液体作为提取剂 ;我们这里讨论的SPE ,是用固体物质作为萃取剂 ,采用高效、高选择性的固定相 进展萃取的样品预处置技术。 SPE技术自上世纪70年代后期问世以来，开展迅速，广泛运用于环境、制药、临床医学、食品等领域 。一、概述借助SPE所

2、要到达的目的是： 1从试样中除去对以后的分析有干扰物质；2富集痕量组分，提高分析灵敏度； 3变换试样溶剂，使之与分析方法想匹配； 4原位衍生； 5试样脱盐。 运用SPE方法，要尽能够防止柱因超载而被穿透，从而影响分析结果的准确性 。一、概述 样品类型 SPE可以用于一切类型样品的处置，但是液体样品是最容易处置的。Survey response %二、SPE根本原理 SPE是一种吸附剂萃取，样品经过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保管在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而到达分别的目的。 SPE的分别方式主要取决于填充剂的类型和溶剂的性质。二、SPE根本原理 SPE也是

3、一个柱色谱分别过程，分别机理、固定相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱HPLC有许多类似之处。 但是SPE柱的填料粒径40m要比HPLC填料310m大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。 因此，用SPE只能分开保管性质有很大差别的化合物。 与HPLC的另一个差别是SPE柱是一次性运用。 三、SPE法的优点 (1 ) 简单、快速和简化了样品预处置操作步骤 ,缩短了预处置时间。 (2 ) 处置过的样品易于贮藏、运输 ,便于实验室间进展质控。 (3 ) 可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂用以处置各种不同类的有机污染物。 (4) 不出现乳化景象 ,提高了分别效率。 (5) 仅用少量

4、的有机溶剂 ,降低了本钱。 (6) 易于与其他仪器联用 ,实现自动化在线分析。四、 SPE安装Cleaned polyethylene fritsSorbent bedLuer tipShrink-wrapped polypropylene五、 SPE的类型 在SPE法中最常用的吸附剂是硅胶或键合相的硅胶即在硅胶外表的硅醇基团上键合不同的有机基团，如烷基链或其它官能团，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。实践上吸附剂角色是由这些新接上的含官能基碳链来完成。 以硅胶为基质的吸附剂主要有以下优点： 粒径e.g.40m)、孔径 e.g.60A、外表积600m2/g)、键合量易控制；机械强度高；

5、化学性质稳定；顺应性广；可运用的溶剂种类多。五、 SPE的类型 硅胶外表的官能团SiSiOH OHFree silanolAdsorbed waterSiloxane bridge (dehydrated silanol)Geminal silanolSi OH2O OOHSi OHBound and reactive silanolsSiSi OSi OHH五、 SPE的类型 根据柱中填料吸附剂来划分，可将SPE法分为吸附型和键合相分配型BPC。 吸附型SPE是采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂，样品进入柱中，分析物的极性官能团先迅速被吸附至极性吸附剂上，而后以低极性溶剂转至中极性溶

6、剂陆续洗去杂质及洗脱出分析物。五、SPE的类型 以硅胶为基质的固定相的分类NON-POLAR PHASESC18OctadecylC2EthylCHCyclohexylPHPhenylPOLAR PHASESCNCyanopropyl2OHDiolNH2AminopropylSISilicaION-EXCHANGE PHASESSCXStrong cation exchangerCBA Weak cation exchangerSAXStrong anion exchangerNH2Weak anion exchangerSPECIALTY PHASESPBACERTIFYENVIRELUTA

7、CCUCATIncreasing polarity五、 SPE的类型 硅胶键合非极性固定相 填充剂运用非极性烷烃类化学键合相 C18、C8、C6H5-C6H11等的SPE分别方式称为反相BPC。最适用于极性基质中萃取非极性化合物。 当样品溶液经过萃取柱时，杂质不被保管，直接经过柱子除去，只需分析物保管在柱上，只需选用一种适宜的洗脱溶剂既可将其从柱上洗下。五、SPE的类型 分析物与非极性固定相的作用力NH2SO3-Van der Waals forcesSilica baseBonded functional group (C8)五、 SPE的类型 硅胶键合极性固定相 填充剂运用极性键合固定相-

8、NH2、-CN、-2OH等官能团的SPE分别方式称为正相BPC。其对极性分析物的吸附力不及分配型SPE大，故洗脱容易。在实践运用中，先以非极性溶剂清洗管柱，继而加样，分析物立刻会被吸附，然后以非极性溶剂洗去杂质，最后以极性溶剂洗脱分析物。五、 SPE的类型 分析物与极性固定相的作用力ODipolar attraction or hydrogen bondingSilica baseNCOOHOHOHH五、 SPE的类型 硅胶键合离子交换剂 填充剂为硅胶基质的离子交换官能团有：季胺、氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基等。 此外常用的还有聚合物，如苯乙烯-而乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相对于键

9、合相填料，聚合物可适用于全部pH范围，因此运用广泛。 对于酸性化合物，如有机酸、无机阴离子、酸性蛋白等，普通采用阴离子交换SPE柱； 对于碱性化合物，如有机胺、金属离子、儿茶酚胺和碱性蛋白等，采用阳离子交换SPE柱。 SCXPRSCBASAXPSANH2Strong anionStrong anion, pKa 1Weak anion, pKa 4.8Strong cationWeak cation, pKa 10.9, 10.1Weak cation, pKa 9.8NHCH2CH2NH20.7meq/g0.3meq/gpH-sensitive0.8meq/gpH-sensitivepH-s

10、ensitiveSO3-SO3-NH2N+Me3CO2H硅胶键合离子交换剂 Weak or Strong Acids/Bases五、SPE的类型 分析物与离子交换剂的作用力NH3+Electrostatic attractionSilica baseOHCO2HSO3- CO2-OCON(CH3)2+N基体对选择适宜分别机制有着重要影响e.g.)NH3+NH2NH2CompoundSuggestedmechanismNon-polarPolarIon exchangeMatrix typeSaline solutionOlive oilDrinking water五、 SPE的类型 混合方式固

11、定相六、 SPE方法的建立 SPE操作步骤包括有柱子类型的选择、柱预处置、加样、洗去干扰物和回收分析物四个步骤。 在加样和洗去干扰物步骤中，部分分析物有能够穿透SPE柱呵斥损失，而在回收分析物步骤中，分析物能够不被完全洗脱，仍有部分残留在柱上。最理想的情况是分析物100%地回收到搜集的组分中，但这并不是总能到达的。 SPE柱子类型的选择1、Reversed-phase bonded silica sorbents having alkyl groups such as octadecyl (C18, C18), octyl (C8, C8), or ethyl (C2, C2) covalen

12、tly bonded to the silica gel backbone or cyclohexyl (CH) or phenyl groups and sorbents composed of polymeric resins such as polystyrenedivinylbenzeneinteract primarily with analytes via van der Waals forces. 2、Nonionic watersoluble compounds can be retained by reversed-phase sorbents but may not be

13、as well retained as analytes that are soluble in methanol or methanolwater miscible mixtures. 3、Normal-phase polar sorbents, such as silica, alumina, and Florisil, and cyano (CN) bonded phases interact by polar-dipole/dipole forces between polar functional groups in the analyte and the polar surface

14、 of the sorbent. 4、Amino (NH2) and diol sorbents interact with analytes by hydrogen bonding. 5、Hexane-soluble analytes are best retained by normalphase sorbents such as silica or Florisil or polar functionally substituted bonded phases such as amino or diol. 6、Strong cation-exchange (SCX) and strong

15、 anion-exchange (SAX) sorbents interact primarily through electrostatic attractions between the sorbent and the analyte. 7、Graphitized carbon sorbents exhibit both nonspecific van der Waals interactions and anionexchange, or electrostatic, attraction for analytes.1、Dependence of Sorption on Sample p

16、H If a compound is ionizable, the extraction will be pH dependent.Monomethyl (MMP), Monoethyl (MEP), Mono-n-propyl (MPRP), Mono-n-butyl (MBP), Mono-n-pentyl (MPEP), Mono-n-octyl (MOP) Phthalates邻苯二甲酸盐酯2、Dependence of Sorption on Sample Volume Breakthrough volume as the point at which 1% of the sampl

17、e concentration at the entrance of the sorbent bed is detected at the outlet of the sorbent bed. The type and quantity of sorbent, hydrophobicity and ionizability of the analytes, and sample volume and pH interactively determine the breakthrough volume. The breakthrough volume for a specific mass of

18、 sorbentcan be established by either loading variable-volume samples of constant concentration or variable-volume samples of variable concentration, in which case the latter comprises a constant molar amount loaded 。Alternatively, methods exist for predicting the breakthrough volume.六、 SPE方法的建立 柱预处置

19、-Condition 柱预处置有两个目的:一个目的是除去填料中能够存在的杂质；另一个目的是使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性。填料未经预处置或者未被溶剂潮湿，能引起溶质过早穿透，影响回收率。 对于非极性相和离子交换SPE柱运用的柱预处置溶剂为易溶于水的甲醇、 乙腈、四氢呋喃和丙酮。通常还要用水或缓冲液洗去残留在柱上的有机溶剂。六. SPE方法的建立 柱预处置-Condition 对于极性的SPE柱，非极性溶剂适宜用于预处置过程 。通常很少有人用极性溶剂去处置极性的SPE柱， 由于极性溶剂会与键合相发生作用 ，减少吸附剂的与样品作用的外表积。六、 SPE方法的建立 柱预处置 Why Condit

20、ion？Conditioned sorbent Unconditioned sorbentGood transport between sampleand sorbent六、 SPE方法的建立 加样- Load Sample 预处置后，试样溶液被加至并经过SPE柱。在该步骤，分析物及杂质被保管在吸附剂上。 为了防止分析物的流失，试样溶剂强度不宜过 高。当以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超越10%V/V。为抑制加样过程中分析物流失，可采用弱溶剂稀释试样、减少试样体积、添加SPE柱中的填料量和选择对分析物有较强保管的吸附剂等手段。 六、 SPE方法的建立 除去干扰杂质-Wa

21、sh 用中等强度的溶剂，将干扰组分洗脱下来，同时坚持分析物仍留在柱上。对反相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲溶液。经过调理清洗溶剂的强度和体积，尽能够多地除去能被洗脱的杂质。 为了决议最正确清洗溶剂的浓度和体积，加试样于SPE柱上，用510倍柱床体积的溶剂清洗，依次搜集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱廓形。添加清洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱廓形，决议清洗溶剂适宜的强度和体积。 六、 SPE方法的建立 分析物的洗脱和搜集-Elution 这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并搜集在最小体积的组分中，同时使比分析物更强保管的杂质尽能够多地仍留在SPE柱上。 洗脱溶剂的强度

22、是至关重要的。较强的溶剂可以使分析物洗脱并搜集在一个小体积的级分中，但有较多的强保管杂质同时被洗脱下来。当用较弱的溶剂洗脱，分析物级分的体积较大，但含较少的杂质。为了提高分析物的浓度或要进展溶剂转换，可以把搜集到的分析物级分用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。六、 SPE方法的建立Retention Rinsing ElutionSample matrix Wash solvent Elution solvent六、 SPE方法的建立 从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多个要素的影响，实验条件是影响重现性的主要缘由。提高重现性的方法有1运用替代物，参与适当的替代物做参比；2参与样品

23、量适当，不超出穿透量和穿透体积；3选择适宜的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。七、 SPE的运用 非极性SPE柱Vitamin K1 from Serum using C83OOSurrogate, vitamin K1(25), contains additional 1-methyl butyl group七. SPE的运用 非极性SPE柱 Condition: 2.0mL MeOH, 1.0mL H2O Load Sample: 50mL serum, 30mL I.S., 1mL H20 Wash: 21.0mL H20, dry under vacuum for 1 minu

24、te Elute: HPLC mobile phase - AcCN/IPA/DCM (7:1:2 v/v) 2150mL SPE柱: C8柱 选择C8是由于维生素K1是亲脂性的 ，并且比C18柱更易于洗脱下来，洗脱之前一定要除去柱上的水分。 分析仪器：HPLC-DAD 检测器七、 SPE的运用 极性SPE柱HO Cholesterol胆固醇 cholesteryl ester胆甾醇酯 Triglyceride甘油三酸酯 Diglyceride甘油二酯 Monoglyceride甘油一酸酯 free fatty acid 脂肪酸 Phospholipid磷脂Class Fractionatio

25、n of a Lipid Mixture on NH2 Sorbent七、 SPE的运用 极性SPE柱 Sample pre-treatment: Plasma lipids were extracted and dried, then reconstituted in CHCl3. Method development started from consideration of lipid structure (possible anion exchange, H-bonding, dipolar and non-polar interactions. TLC data provided i

26、ndication on suitable sorbent types for screening. Solubility data was also used to devise suitable wash/elution solvent trials.七、 SPE的运用 极性SPE柱 Solvent type P Lipid class eluted A 2:1 CHCl3/IPA 4.07 All neutral lipids B 2% AcOH in EtOEt 2.86 Fatty acids C MeOH 5.10 All phospholipids D Hexane 0.01 C

27、holesteryl esters E 1% EtOEt/10% 0.44 Triglycerides DCM in hexane F 5% EtOAc in hexane 0.32 Cholesterol G 15% EtOAc in hexane 0.62 Diglycerides H 1:1 CHCl3/MeOH 4.43 Monoglycerides七、 SPE的运用 极性SPE柱C, CETG, DG, MGCEPLACDPLFABC, TGDGMGCEDFAPLC, TGDGMGA three cartridge sequence that permits best separation七、SPE的运用 极性SPE柱CCFFMGHCTGEDGMGCDGMGDGGMGCombine extractsStack cartridgesSeparateafter extractio